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yeahter1789銅蟲 (小有名氣)
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【分享】熒光定量PCR實驗指南（一） 已有20人參與
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一、 基本步驟： 1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對； 2、 引物、探針的設(shè)計； 3、 引物探針的合成； 4、 反應(yīng)體系的配制； 5、 反應(yīng)條件的設(shè)定； 6、 反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化； 7、 熒光曲線和數(shù)據(jù)分析； 8、 標準品的制備； 二、 技術(shù)關(guān)鍵： 1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對； 從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接點擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“import”，打開后點擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，點擊“add” 或“add all”，然后點擊“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點擊“assemble”進行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。有時因為參數(shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個組，點擊“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時因此個別序列原因，會出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性最好的排列。然后，點擊“save”保存即可。分析時，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。 2、 引物和探針設(shè)計 2.1引物設(shè)計 細心地進行引物設(shè)計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點： 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段； 擴增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別： sybr green I技術(shù)對片段長度沒有特殊要求； Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp－150bp； 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對； 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%； 引物之間的TM相差避免超過2℃； 引物的3’端避免使用堿基A； 引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。 為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子。 2.2 Taqman 探針設(shè)計 一般設(shè)計原則： 探針位置盡可能地靠近上游引物； 探針長度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。 探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 2.3 Taqman MGB 探針設(shè)計介紹 MGB探針的優(yōu)點： MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。 短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。 MGB探針的設(shè)計原則 探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針水解為單個堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。 用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。 2.4 實時多重PCR探針的選擇： 多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴增不同長度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。 多重實時PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。 在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析: 設(shè)計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計的多重探針后，在“report”菜單下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。 3、 影響PCR及熒光PCR 的其他因素 引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要�？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。 3.1 引物退火溫度 引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法——從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃�；蛘邽榱颂岣咛禺愋�，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴謹?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 3.2 引物濃度 引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。 一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。 濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD） 舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得： 濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM 3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性 定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。 引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。 引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。 探針即寡核苷酸進行熒光基團的標記，標記本身有效率的區(qū)別。探針標記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標記效率和純度有很大的區(qū)別。 由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。 3.4 熱啟動 熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 Transitor® Hot Start Taq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機粘連而形成的非特異性擴增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴增的進行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。 3.5鎂離子濃度 鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。 3.6 模板質(zhì)量 模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標準基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。 3.7 模板濃度 起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴增和熒光PCR擴增，104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大�。ㄏ卤恚Ｅe例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當于3×104到3×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。當然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。 表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例 基因組 DNA Size(bp)* Target Molecules/µg of Genomic DNA Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules E. coli 4.7×10^6 1.8×10^8 0.001 Saccharomyces cerevisiae 2.0×10^7 4.5×10^7 0.01 Arabidopsis thaliana 7.0×10^7 1.3×10^7 0.01 Drosophila melanogaster 1.6×10^8 6.6×10^5 0.5 Homo sapiens 2.8×10^9 3.2×10^5 1.0 Xenopus laevis 2.9×10^9 3.1×10^5 1.0 1.0Mus musculus 3.3×10^9 2.7×10^5 1.0 Zea mays 1.5×10^10 6.0×10^4 2.0 pUC 18 plasmid DNA 2.69×10^3 3.4×10^11 1×10^(-6) 3.8 防止殘余（Carry-over）污染 PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。 可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。 使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。 一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物 |
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[考研] 【考研調(diào)劑】化學(xué)專業(yè) 281分，一志愿四川大學(xué)，誠心求調(diào)劑 +7 | 吃吃吃才有意義 2026-03-19 | 7/350 |
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[考研] 324求調(diào)劑 +5 | lucky呀呀呀鴨 2026-03-20 | 5/250 |
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[考研] 藥學(xué)383 求調(diào)劑 +3 | 藥學(xué)chy 2026-03-15 | 5/250 |
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[考研] 316求調(diào)劑 +5 | 梁茜雯 2026-03-19 | 5/250 |
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[考研] 086500 325 求調(diào)劑 +3 | 領(lǐng)帶小熊 2026-03-19 | 3/150 |
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[考研] 材料學(xué)碩318求調(diào)劑 +5 | February_Feb 2026-03-19 | 5/250 |
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[考研] 一志愿西安交通大學(xué)材料工程專業(yè) 282分求調(diào)劑 +5 | 楓橋ZL 2026-03-18 | 7/350 |
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[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
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[考研] 286求調(diào)劑 +6 | lemonzzn 2026-03-16 | 10/500 |
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[考研] 一志愿985，本科211，0817化學(xué)工程與技術(shù)319求調(diào)劑 +10 | Liwangman 2026-03-15 | 10/500 |
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[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑，求各位老師收留 +10 | 秋有木北 2026-03-14 | 10/500 |
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[考研] 344求調(diào)劑 +6 | knight344 2026-03-16 | 7/350 |
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[考研] 【同濟軟件】軟件（085405）考研求調(diào)劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
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[考研] 一志愿武理材料305分求調(diào)劑 +5 | 想上岸的鯉魚 2026-03-18 | 6/300 |
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[考研] 278求調(diào)劑 +5 | 煙火先于春 2026-03-17 | 5/250 |
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[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
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[考研] 275求調(diào)劑 +4 | 太陽花天天開心 2026-03-16 | 4/200 |
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[考研] 0854控制工程 359求調(diào)劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
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[考研] 321求調(diào)劑 +5 | 大米飯！ 2026-03-15 | 5/250 |
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[考研] 288求調(diào)劑 +4 | 奇點0314 2026-03-14 | 4/200 |
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