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yeahter1789銅蟲(chóng) (小有名氣)
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【分享】熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)指南（一） 已有20人參與
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一、 基本步驟： 1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對(duì)； 2、 引物、探針的設(shè)計(jì)； 3、 引物探針的合成； 4、 反應(yīng)體系的配制； 5、 反應(yīng)條件的設(shè)定； 6、 反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化； 7、 熒光曲線和數(shù)據(jù)分析； 8、 標(biāo)準(zhǔn)品的制備； 二、 技術(shù)關(guān)鍵： 1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對(duì)； 從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開(kāi)某個(gè)序列后，直接點(diǎn)擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱(chēng)中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后，再打開(kāi)DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“import”，打開(kāi)后點(diǎn)擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱(chēng)中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后要對(duì)所有的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點(diǎn)擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，點(diǎn)擊“add” 或“add all”，然后點(diǎn)擊“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點(diǎn)擊“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時(shí)要設(shè)定比較序列的開(kāi)始與結(jié)尾。有時(shí)因?yàn)閰?shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認(rèn)設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個(gè)組，點(diǎn)擊“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個(gè)“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時(shí)因此個(gè)別序列原因，會(huì)出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對(duì)“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個(gè)序列的真實(shí)且排列同源性最好的排列。然后，點(diǎn)擊“save”保存即可。分析時(shí)，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對(duì)于彌散性的紅色是不可用的。 2、 引物和探針設(shè)計(jì) 2.1引物設(shè)計(jì) 細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿(mǎn)意的特點(diǎn)： 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別： sybr green I技術(shù)對(duì)片段長(zhǎng)度沒(méi)有特殊要求； Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp； 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)； 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%； 引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃； 引物的3’端避免使用堿基A； 引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。 為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。 2.2 Taqman 探針設(shè)計(jì) 一般設(shè)計(jì)原則： 探針位置盡可能地靠近上游引物； 探針長(zhǎng)度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。 探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 2.3 Taqman MGB 探針設(shè)計(jì)介紹 MGB探針的優(yōu)點(diǎn)： MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。 短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。 MGB探針的設(shè)計(jì)原則 探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹�(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。 用primerexpress軟件評(píng)價(jià)Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長(zhǎng)度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。 原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到(MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào))。因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿(mǎn)足上述要求的4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離3’端2個(gè)堿基的前方(即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是絕對(duì)的保守)，以進(jìn)行SNP檢測(cè)。反過(guò)來(lái)，若要進(jìn)行同類(lèi)檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個(gè)bp,探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測(cè)到突變。 2.4 實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇： 多重實(shí)時(shí)PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測(cè)時(shí)可根據(jù)熒光的顏色來(lái)判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片段的Tm值來(lái)判定不同的物品。 多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類(lèi)型：如同時(shí)為T(mén)aqman 探針、或同時(shí)為MGB探針、或同時(shí)為Beacon 探針。 在多重PCR中，多重PCR的各個(gè)引物之間相互干擾和各個(gè)探針之間相互干擾分析: 設(shè)計(jì)好各對(duì)引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開(kāi)保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重探針后，在“report”菜單下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè)dimer，并對(duì)此對(duì)引物用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。 3、 影響PCR及熒光PCR 的其他因素 引物的設(shè)計(jì)和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR尤其重要�？梢哉f(shuō)，不合理的設(shè)計(jì)意味著絕對(duì)的失敗。但是，好的設(shè)計(jì)并不等于好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。 3.1 引物退火溫度 引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 3.2 引物濃度 引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測(cè)量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過(guò)Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計(jì)算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。 一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個(gè)堿基長(zhǎng)的引物，1個(gè)O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計(jì)算出一定的工作濃度下，引物的加水量。 濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD） 舉例：計(jì)算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測(cè)吸光度為0.2。計(jì)算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得： 濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM 3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性 定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過(guò)程中的任何非全長(zhǎng)序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個(gè)循環(huán)過(guò)程，在每個(gè)堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物，尤其是大于50個(gè)堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽�，可能需要純化�?br /> 引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。 引物的穩(wěn)定性依賴(lài)于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。 探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時(shí)間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。 由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。 3.4 熱啟動(dòng) 熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如定點(diǎn)突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。 熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 Transitor® Hot Start Taq酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來(lái)說(shuō)高效可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒(méi)有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會(huì)產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會(huì)被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會(huì)被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過(guò)程中要持續(xù)20分鐘才會(huì)被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。 3.5鎂離子濃度 鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如DNA聚合酶的活性，這會(huì)影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會(huì)影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對(duì)鎂離子優(yōu)化的依賴(lài)，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。 3.6 模板質(zhì)量 模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會(huì)抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時(shí)就會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。 3.7 模板濃度 起始模板的量對(duì)于獲得高產(chǎn)量很重要。對(duì)大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個(gè)起始目的分子就足以觀測(cè)到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說(shuō)，100ng到1μg的人類(lèi)基因組DNA，相當(dāng)于3×104到3×105個(gè)分子，足以檢測(cè)到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級(jí)的。對(duì)于一般的檢測(cè)樣品，10－100ng的量就足夠檢測(cè)了。當(dāng)然對(duì)模板做一個(gè)梯度稀釋?zhuān)瑢?duì)于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。 表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例 基因組 DNA Size(bp)* Target Molecules/µg of Genomic DNA Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules E. coli 4.7×10^6 1.8×10^8 0.001 Saccharomyces cerevisiae 2.0×10^7 4.5×10^7 0.01 Arabidopsis thaliana 7.0×10^7 1.3×10^7 0.01 Drosophila melanogaster 1.6×10^8 6.6×10^5 0.5 Homo sapiens 2.8×10^9 3.2×10^5 1.0 Xenopus laevis 2.9×10^9 3.1×10^5 1.0 1.0Mus musculus 3.3×10^9 2.7×10^5 1.0 Zea mays 1.5×10^10 6.0×10^4 2.0 pUC 18 plasmid DNA 2.69×10^3 3.4×10^11 1×10^(-6) 3.8 防止殘余（Carry-over）污染 PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來(lái)源的污染。這稱(chēng)之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源（非殘余污染）。 可以在PCR過(guò)程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套�？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫�(duì)照檢測(cè)污染。 使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。 一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱(chēng)為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過(guò)程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感，所有可以在PCR前對(duì)新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物 |
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mczhang
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