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thinkerboy鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
怎么獲取雞的一段未被報道的基因
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沒有師姐沒有師兄，現(xiàn)在導(dǎo)師要我根據(jù)其他已報道的人或動物的nod2基因，進行同源比對找到保守區(qū)，設(shè)計引物，然后通過提mRNA——cDNA，通過RACE擴增出雞的nod2全基因。跪求具體方法�。�，我通過NCBI找到人和小鼠的nod2基因，也用blast對這兩個基因比對了，但結(jié)果也就是堿基序列的一一對應(yīng)和一個有顏色的數(shù)軸圖，請問我該怎么設(shè)計引物。 根據(jù)上面的描述我該怎么由比對的結(jié)果設(shè)計引物，還有就是引物要跨越內(nèi)含子是什么意思？引物一定要設(shè)計在CD區(qū)的上游嗎，還是要怎么樣啊？本人沒設(shè)計過引物，求具體具體再具體的方法啊 |
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gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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thinkerboy: 回帖置頂 2012-12-05 18:05:13
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你這個應(yīng)該做簡并引物PCR，而且比對不是比對的是DNA序列，而是比對是的氨基酸序列，找出保守序列，然后再設(shè)計簡并引物。 具體步驟如下： 一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列 因為密碼子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)氨基酸序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中查找與之相似的氨基酸序列，并保存所有搜索到的序列。 二、對所找到的序列進行多序列比對 將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有Clustal W，也可在線分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其結(jié)果如下圖所示, 所有序列的共有部分將會顯示出來。“*” 表示保守，“：” 表示次保守。 三、確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50～ 400個aa為宜，從而使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對�？傊�，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。 四、利用軟件設(shè)計引物 當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了，其中pp5支持簡并引物的設(shè)計，將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差一個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會有數(shù)對，分數(shù)越高越好。 |
2樓2012-12-05 17:42:19
thinkerboy
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3樓2012-12-05 18:03:31
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