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thinkerboy鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
怎么獲取雞的一段未被報(bào)道的基因
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沒(méi)有師姐沒(méi)有師兄，現(xiàn)在導(dǎo)師要我根據(jù)其他已報(bào)道的人或動(dòng)物的nod2基因，進(jìn)行同源比對(duì)找到保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物，然后通過(guò)提mRNA——cDNA，通過(guò)RACE擴(kuò)增出雞的nod2全基因。跪求具體方法�。�，我通過(guò)NCBI找到人和小鼠的nod2基因，也用blast對(duì)這兩個(gè)基因比對(duì)了，但結(jié)果也就是堿基序列的一一對(duì)應(yīng)和一個(gè)有顏色的數(shù)軸圖，請(qǐng)問(wèn)我該怎么設(shè)計(jì)引物。 根據(jù)上面的描述我該怎么由比對(duì)的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，還有就是引物要跨越內(nèi)含子是什么意思？引物一定要設(shè)計(jì)在CD區(qū)的上游嗎，還是要怎么樣啊？本人沒(méi)設(shè)計(jì)過(guò)引物，求具體具體再具體的方法啊 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
thinkerboy: 回帖置頂 2012-12-05 18:05:13
1949stone: MolEPI+1, 果然是神 2012-12-05 19:41:57
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
thinkerboy: 回帖置頂 2012-12-05 18:05:13
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thinkerboy: 金幣+2 2012-12-12 13:31:29
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你這個(gè)應(yīng)該做簡(jiǎn)并引物PCR，而且比對(duì)不是比對(duì)的是DNA序列，而是比對(duì)是的氨基酸序列，找出保守序列，然后再設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 具體步驟如下： 一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列 因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)氨基酸序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過(guò)蛋白查蛋白)，在整個(gè)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的氨基酸序列，并保存所有搜索到的序列。 二、對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì) 將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有Clustal W，也可在線分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其結(jié)果如下圖所示, 所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)�！�*” 表示保守，“：” 表示次保守。 三、確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50～ 400個(gè)aa為宜，從而使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)aa的保守區(qū)域，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)�？傊�，究竟要選多少序列來(lái)比對(duì)，要根據(jù)前一次比對(duì)的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。 四、利用軟件設(shè)計(jì)引物 當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專(zhuān)業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了，其中pp5支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)，將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差一個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。 |
2樓2012-12-05 17:42:19
thinkerboy
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3樓2012-12-05 18:03:31
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