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hunzi鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌Red重組法基因敲除求助 已有1人參與
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我做大腸桿菌基因敲除，用的gene bridge的red/etrecombinantion試劑盒，按照里面的步驟，現(xiàn)在出現(xiàn)如下問(wèn)題： 用阿拉伯糖誘導(dǎo)與不用阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌，轉(zhuǎn)入重組片段后，kan篩選的板上長(zhǎng)了很多很多，但是pcr全都驗(yàn)證不出來(lái)，也換了引物，kit中的陽(yáng)性對(duì)照的菌都能擴(kuò)出來(lái)。。。按照理論，應(yīng)該是阿拉伯糖誘導(dǎo)了的才能啟動(dòng)重組，板上長(zhǎng)出克隆，而沒(méi)有誘導(dǎo)的菌轉(zhuǎn)入重組片段不能發(fā)生重組，kan板上就不能長(zhǎng)。。。備注，用kan處理沒(méi)有轉(zhuǎn)入片段的菌，菌不能長(zhǎng)。。。 求高手指教，并分享經(jīng)驗(yàn)，告訴我每一步應(yīng)該注意什么，然后我優(yōu)化優(yōu)化條件，看能不能做出來(lái)，多謝各位 |
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蝸牛-killer
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2樓2012-12-31 11:57:24
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3樓2013-05-13 09:15:34
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4樓2013-05-13 14:24:42
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6樓2013-09-07 14:57:43
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1)看你使用的Kan濃度，由于重組替換是單拷貝，不如質(zhì)粒表達(dá)強(qiáng)烈，一般要求常規(guī)用量一半的kn，當(dāng)用量不準(zhǔn)或kn失效都會(huì)造成假陽(yáng)性；（2）涂板的稀釋梯度問(wèn)題，不能原液涂，要10倍稀釋?zhuān)駝t有假陽(yáng)性，一般1個(gè)平板會(huì)有10-100個(gè)正確克隆。（3)商家提供的試劑盒問(wèn)題。如果覺(jué)得麻煩或經(jīng)驗(yàn)不足，可以委托公司做，如：廣州邁博生物科技有限公司 7樓2016-03-12 11:52:41
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