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無(wú)形居士2009金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
如何充分形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)
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| 想把DNA單鏈通過(guò)退火使發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，可是跑膠后發(fā)現(xiàn)有一部分二聚體的形成~~急求各位大俠們，如何使它形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時(shí)避免二聚體的行程呢？退火溫度怎么控制？？有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)們分享一下吧~ |
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2樓2012-12-27 09:49:16
無(wú)形居士2009
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3樓2012-12-27 09:51:39
4樓2012-12-27 11:56:55
wen1023tao
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
無(wú)形居士2009: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-12-27 14:05:09
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-12-27 16:57:45
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可以再PCR儀上95度10min，然后緩慢降溫到退火溫度，65度左右 ，立即拿出來(lái)在室溫自然緩慢冷卻30min，然后做連接 這個(gè)是我當(dāng)時(shí)構(gòu)建RNAi時(shí)用的體系，可以試試，希望有所幫助，還有就是要死引物序列不好，形成二聚體是不可避免的 |
5樓2012-12-27 12:27:09
無(wú)形居士2009
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6樓2012-12-27 14:07:45
wen1023tao
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+4, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-12-27 16:57:57
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沒(méi)有PCR儀比較麻煩，需要高溫讓DNA變性，形成二聚體的DNA解鏈成單鏈，慢慢退火降溫的復(fù)性過(guò)程中，就可以最大程度上形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，實(shí)在不行用干浴鍋或者水浴鍋代替，一個(gè)94度，一個(gè)65度，只是這樣沒(méi)有做過(guò)，不知道效果怎么樣，降溫過(guò)程不能降得太快，要在退火溫度那里停留下，盡量讓發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成，否則還沒(méi)來(lái)得及形成發(fā)夾就過(guò)溫度，立馬復(fù)性，很多地方隨意配對(duì) ，發(fā)夾結(jié)構(gòu)就更少了 |
7樓2012-12-27 15:41:21
無(wú)形居士2009
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wangliually
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歸零162312
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