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cdmmore銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
轉(zhuǎn)化子太多假陽(yáng)性，怎么辦呀？
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我用Nde1和Xho1雙酶切pET28a和目的基因，連接轉(zhuǎn)化后驗(yàn)證了15個(gè)轉(zhuǎn)化子，都是空載體。1、還要不要繼續(xù)驗(yàn)證呀？2、我兩種酶是同時(shí)加的，同步酶切，這樣有沒(méi)有什么問(wèn)題？3、為何會(huì)出現(xiàn)那么多空載體呀，怎么辦？ 先謝謝各位大俠啦！ |
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cdmmore
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3樓2013-01-03 16:32:57
cicelyzh
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-07 17:07:10
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如果空載體很多，說(shuō)明酶切有問(wèn)題才連不上的。我覺(jué)得最好不要再驗(yàn)證了，從新酶切連接轉(zhuǎn)化。 首先你要確定兩個(gè)酶都是工作的。分別單切載體都能完全切開(kāi)。 我也用NdeI做克隆，第一次也沒(méi)有出。以我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，所有這些普通的克隆應(yīng)該是one shot就差不多的。NdeI活性很強(qiáng)，時(shí)間稍長(zhǎng)就會(huì)切過(guò)，酶也不要加多。我覺(jué)得你可以先不加NdeI切XhoI, 覺(jué)得切開(kāi)了再加NdeI切20-30分鐘就可以了。 |
2樓2013-01-03 14:37:35
egaoxy
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4樓2013-01-03 21:22:50
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5樓2013-01-03 21:50:01
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