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imyting至尊木蟲 (正式寫手)
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[求助]
小肽電泳低于5KD的小肽看不到條帶
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| 本人正在做的小肽是2.5KD,使用的是中科瑞泰生物公司的超低蛋白maker，其中3.5和1.4KD 的條帶看不見。不知道是什么原因，求小肽電泳達(dá)人指教。 |
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imyting
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wizardfan: 金幣+3, 謝謝補(bǔ)充信息，以后記得開帖的時(shí)候提供盡可能多的信息，以更快的獲得幫助 2013-01-17 04:00:43
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我的電泳就是按照這個(gè)說明書做的，希望大家?guī)兔纯从惺裁纯梢愿倪M(jìn)的地方: 超低分子量蛋白質(zhì)Marker II（1.4-26.6kD） Ultra Low Molecular Weight Protein Marker II ●產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格： RTD6107 10T（100μl） ● 儲(chǔ)存條件： -20℃保存，開封后有效期12個(gè)月。 ● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 本產(chǎn)品包含2種多肽和4種低分子量蛋白質(zhì)組成，可以用來判斷 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。分子量范圍為1.4kD-26.6kD，分子量大小為1.4kD，3.5kD，6.5kD，14.2kD，16.9kD，26.6kD。 ● 使用說明： 1. 超低分子量多肽的蛋白電泳較常規(guī)的蛋白電泳更為復(fù)雜，請(qǐng)仔細(xì)參閱說明書后再進(jìn)行操作。 2. 收到產(chǎn)品后，室溫徹底融化混勻后，離心快甩將溶液收集到管底，根據(jù)需要適量分裝，-20℃貯存，每次使用時(shí)取一管使用。 3. 本產(chǎn)品已經(jīng)含有了樣品緩沖液，使用前取一管Marker樣品室溫徹底融化后，95℃預(yù)熱5分鐘即可上樣電泳，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色后可見6條蛋白帶。一般說來，0.75mm×5mm（厚度×寬度）的加樣孔上樣10μl，其他規(guī)格梳子請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整上樣量。 注：一次熱處理后，未用盡樣品-20℃保存；下次使用時(shí)只要室溫完全融化混勻后即可上樣，可以不用再加熱處理。 4. 制膠：先配制分離膠，聚合后再配制濃縮膠。電泳時(shí)，80-100v跑30-60分鐘左右，待指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，把電壓調(diào)至150-200v，至藍(lán)色指示前沿至分離膠3/4位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過程大約需要3-4個(gè)小時(shí)。注：如果電泳時(shí)間過短，染色時(shí)，指示前沿容易遮擋1.4kD和3.5kD條帶。 5. 如果關(guān)心較小的多肽（小于5KD），電泳之后可將膠置于固定液中固定30分鐘，再進(jìn)行染色，能得到較好的蛋白條帶；如果不固定直接染色，小蛋白會(huì)不清楚。如果使用配方7進(jìn)行染色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇本公司的考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液（目錄號(hào)：RTD6201），該產(chǎn)品具有染色快，無毒，靈敏性高等特點(diǎn)，在小肽的染色中有更大的優(yōu)勢(shì)，是常規(guī)染色液的理想替代品。 6. 當(dāng)用配方7進(jìn)行染色時(shí)，由于超低分子量多肽極易從凝膠中浸出，因此染色時(shí)間不要太長(zhǎng)，染色一般要1個(gè)小時(shí)左右（最多不要超過1.5小時(shí)）。 （背面續(xù)：凝膠配方） ● 附：小分子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳試劑配制 1. 40%PAA（29:1）（配制濃縮膠） 丙稀酰胺 38.67 g 甲叉雙丙稀酰胺 1.33 g 用ddH2O溶解后定容至100 ml，過濾后使用。 貯存：4℃ 2. 40% PAA（19:1） （配制分離膠） 丙稀酰胺 38 g 甲叉雙丙稀酰胺 2 g 用ddH2O溶解后定容至100 ml，過濾后使用。 貯存：4℃ 3. 凝膠緩沖液（配制凝膠用） [3M Tris; 0.3% SDS; pH8.45] Tris堿 182g ddH2O 300ml 1.5 g SDS或15ml 10％ SDS 用HCl調(diào)pH值至8.45 用ddH2O定容至500ml 貯存：4℃ 4. 10×陽極緩沖液（下槽緩沖液） [1M Tris pH8.9] Tris堿 121.1g ddH2O 400ml 用HCl調(diào)pH值至8.9 用ddH2O定容至500ml 貯存：4℃ 注：使用前稀釋成1×陽極緩沖液使用。 5. 10×陰極緩沖液（上槽緩沖液） [1M Tris; 1M Tricine ;1% SDS; pH 8.25] Tris堿 121.14 g Tricine 179.2 g SDS 10g 用ddH2O溶解， 用HCl調(diào)節(jié)pH至8.25，定容至1000ml。 貯存：4℃ 注：使用前稀釋成1×陰極緩沖液使用 6. 固定液 5％ 戊二醛溶液 注：此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。 7. 染色液 冰醋酸 100ml 考馬斯亮藍(lán)G-250 0.25g 水 900ml 8. 脫色液 冰醋酸 100ml 水 900ml 9. 2×Tricine蛋白樣品上樣緩沖液（10ml） 1ml 1M Tris-Cl pH6.8 2.4ml 甘油 0.8g SDS 0.31g DTT（或者400μl β-巰基乙醇） 2mg 考馬斯亮藍(lán)G-250 用滅菌ddH2O定容至10ml 混勻分裝-20℃貯存?zhèn)溆?br /> 超低分子量蛋白Marker凝膠的配制方法： （一塊0.75mm mini膠用量） 分離膠 濃縮膠 18％T, 5%C /6.0 ml 5％T, 3.3%C/4 ml 40% PAA（19:1） 2.7 ml / 40% PAA (29:1) / 0.5 ml 凝膠緩沖液 1.5 ml 1 ml 乙二醇（電泳級(jí)） 1.8 ml / ddH2O / 2.5 ml 10％APS 45 μl 30 μl TEMED 9 μl 6 μl 超低分子量蛋白Marker 配套試劑 名稱 貨號(hào) 規(guī)格 貯存 超低分子量蛋白Marker I（3.3-20.1kD） RTD6101 10次（100μl） -20℃ 超低分子量蛋白Marker II（1.4-26.6kD） RTD6107 10次（100μl） -20℃ 彩虹預(yù)染超低分子量蛋白Marker（1.2-45kD） RTD6110 10次 （50μl） -20℃ 40% PAA（19:1） AC1914 100ml 4℃ 40% PAA（29:1） AC2914 100ml 4℃ 凝膠緩沖液 GB010 100ml 4℃ 滅菌水 DE005 100ml 室溫 10% APS AP020 5×1ml -20℃ TEMED TE040 10ml 室溫 10×陽極緩沖液 AB080 100ml 4℃ 10×陰極緩沖液 CB010 100ml 4℃ 2×Tricine 上樣緩沖液 TP050 5×1ml -20℃ 考馬斯亮藍(lán)快速染色液 RTD6201 500ml 4℃ 乙二醇 EA0582 25ml 室溫 50%戊二醛 AM155 50ml 4℃ |
7樓2013-01-07 14:34:57
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9樓2013-01-07 15:24:26
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