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mollyzhang鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[交流]
Vemurafenib：首個(gè)獲批的抗BRAF突變腫瘤藥 已有1人參與
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摘要：驅(qū)動(dòng)型原癌基因的識(shí)別提供了重要的、可以改變整個(gè)腫瘤治療藍(lán)圖的藥物靶標(biāo)。其中一個(gè)例子就是BRAF原癌基因，它存在于大約半數(shù)黑色素瘤中，也存在于其他幾種腫瘤中。作為一個(gè)可以作為靶標(biāo)的激酶，BRAF成為了小分子藥物研發(fā)中非常重要的一個(gè)靶點(diǎn)。隨著一系列快速臨床研發(fā)流程的實(shí)現(xiàn)，vemurafenib（Zelboraf；Plexxikon/Roche）于2011年8月用于治療BRAF突變型轉(zhuǎn)移性黑色素瘤在美國(guó)獲批，并在2012年2月在歐盟也獲得批準(zhǔn)。本篇綜述主要描述以下幾方面：BRAF的潛在生物性、用于篩選識(shí)別vemurafenib的技術(shù)手段、它的臨床研發(fā)過程以及從它的研發(fā)過程中所吸取到的經(jīng)驗(yàn)。 RAF絲氨酸/蘇氨酸激酶是重要的信號(hào)集合因子，他們的起始成員RAF是作為一個(gè)病毒性原癌基因大約在30年前被發(fā)現(xiàn)的。作為一個(gè)原癌基因，RAF參與了腫瘤細(xì)胞的增殖過程。對(duì)于人源同系物CRAF的克隆，使得人類基因組中另外兩個(gè)同系物ARAF和BRAF被發(fā)現(xiàn)。就像接下來所描述的，RAF激酶家族在生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中占據(jù)重要的地位（圖16）。 圖16 RAF通路。生長(zhǎng)因子通常與酪氨酸激酶受體（RTK）結(jié)合，RTK通過自磷酸化（用Y-P標(biāo)識(shí)）來激活下游信號(hào)通路，包括RAS，RAF，ERK和MAPK/ERK激酶MEK。RAF激酶活性啟動(dòng)一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同過直接磷酸化MEK，從而磷酸化ERK，ERK進(jìn)入核內(nèi)，從而改變基因表達(dá)。在其被發(fā)現(xiàn)的多年后，RAF才被證明為RAS的下游因子。RAS通過GDP結(jié)合形式與GTP結(jié)合形式的轉(zhuǎn)化來調(diào)控多種效應(yīng)子。RAS-GTP與RAF直接結(jié)合的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了人們發(fā)現(xiàn)了膜結(jié)合RAS-GTP募集RAF上膜，從而產(chǎn)生激活效應(yīng)激酶。同很多別的激酶一樣，RAF家族成員通過二聚化、磷酸化和非磷酸化調(diào)控。BRAF-BRAF和CRAF-CRAF二聚體以及BRAF-CRAF異二聚體都已被證明。ERK等下游信號(hào)的反饋磷酸化調(diào)節(jié)可以部分地去二聚化。 在2002年，研究發(fā)現(xiàn)BRAF在很多不同類型腫瘤中都發(fā)生了突變，這使得人們對(duì)于BRAF的功能理解前進(jìn)了一大步。尤其是，大多數(shù)突變都發(fā)生在同一個(gè)密碼子中，即密碼子600，最典型的是由谷氨酸代替了纈氨酸（V600E突變）。這一密碼子處于BRAF的活性環(huán)中，這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)激酶中都用于調(diào)控激酶活性，而突變（通常為V600E）的發(fā)生可以最終促進(jìn)激酶活性，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖。并且這一突變?cè)诖蠹s半數(shù)的黑素瘤中以及其他許多腫瘤類型中出現(xiàn)。 雖然BRAF已經(jīng)成為了一個(gè)抗腫瘤靶點(diǎn)，但是RAF激酶多年都無法產(chǎn)生結(jié)晶結(jié)構(gòu)，阻礙了特異性化合物的識(shí)別。隨著對(duì)RAF家族的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向BRAF，以及sorafenib這個(gè)相對(duì)可能的抑制劑的出現(xiàn)，在2004年，首個(gè)晶體結(jié)構(gòu)終于問世。就像下面要提到的，結(jié)構(gòu)信息對(duì)于vemurafenib的發(fā)現(xiàn)非常重要。 這里我們將描述發(fā)現(xiàn)vemurafenib的方法論，以及對(duì)于最終導(dǎo)致其獲批用于BRAF突變型轉(zhuǎn)移性黑色素瘤治療的臨床前和臨床數(shù)據(jù)。 Scaffold為基礎(chǔ)的激酶抑制劑研發(fā) 激酶抑制劑是整個(gè)20世紀(jì)80和90年代，大多數(shù)大型制藥公司的研發(fā)重點(diǎn)。到21世紀(jì)初為止，傳統(tǒng)的利用高通量篩選大型化合物庫方法已發(fā)現(xiàn)了幾種抑制激酶活性的化合物類型，例如喹唑啉類、氨基嘧啶、羥吲哚、二芳基脲類。但是，這其中并沒有理想的活性用以抑制BRAF。Plexxikon公司探尋一種能夠識(shí)別針對(duì)激酶的新scaffolds（實(shí)際上是任何想要的有晶體結(jié)構(gòu)的蛋白家族）的開發(fā)途徑，從而探尋新的化學(xué)空間以及新的結(jié)合形式。研究者應(yīng)用這一scaffold為基礎(chǔ)的方法識(shí)別了新的激酶抑制劑。這一方法篩選了具有選擇性化學(xué)特性的小分子化合物，來最大化樣品的化學(xué)空間，從而得到了20000個(gè)化合物。然后應(yīng)用生化試劑盒來讀取大量的動(dòng)力學(xué)信號(hào)數(shù)據(jù)，再下一步應(yīng)用共結(jié)晶的方法。通過激酶與化合物的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)可以清楚地找到真正結(jié)合的化合物，從而新的化合物類型被識(shí)別。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息，化學(xué)家、計(jì)算化學(xué)家以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們可以篩選出最佳的化合物前體，從而合理地進(jìn)行改造。 為了構(gòu)建一個(gè)針對(duì)BRAF的穩(wěn)定表達(dá)結(jié)晶系統(tǒng)，研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)縮短的高溶解性的激酶片段。利用這一方法，確定了超過100個(gè)與BRAF結(jié)合的化合物的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)。通過反復(fù)修飾，在一年的時(shí)間里，就發(fā)現(xiàn)了vemurafenib和PLX4720（一種在嚙齒類中有更好藥代動(dòng)力學(xué)的姐妹藥）。這兩個(gè)化合物具有最佳的結(jié)合力、選擇性和藥代動(dòng)力學(xué)特征。 Vemurafenib的生物學(xué)特性 Vemurafenib在2005年早期首次合成。雖然，在生化試驗(yàn)中，相對(duì)于野生型BRAF，它對(duì)于BRAF的V600E突變型的選擇性不顯著，但是，在黑色素瘤或者是結(jié)直腸癌細(xì)胞系試驗(yàn)中，它對(duì)于突變型的選擇性是非常顯著的。這一顯著的細(xì)胞水平上的選擇性，可能部分地由BRAF突變細(xì)胞對(duì)MEK（MAPK/ERK 激酶，也叫MAPKK）抑制劑的高特異性來解釋。研究表明，如果BRAF是增殖的驅(qū)動(dòng)因子，那么MAPK信號(hào)通路就對(duì)于細(xì)胞增殖非常重要。雖然vemurafenib和MEK抑制劑都抑制細(xì)胞增殖，但是它們的藥效動(dòng)力學(xué)并不相同。MEK抑制劑無細(xì)胞差異地抑制ERK磷酸化，而vemurafenib僅抑制BRAF突變細(xì)胞的ERK磷酸化。 雖然vemurafenib對(duì)于不同組織來源的細(xì)胞系具有顯著差異，但是，vemurafenib對(duì)于BRAF600密碼子突變的細(xì)胞具有顯著的影響。從而，BRAF V600E黑色素瘤、結(jié)直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系的增殖均可以被vemurafenib抑制。 當(dāng)在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)vemurafenib敏感的BRAF突變細(xì)胞系被異體移植到體內(nèi)后，這些移植體仍然對(duì)于口服vemurafenib敏感。我們選擇了一個(gè)適度敏感的帶有 BRAFV600E突變的COLO205結(jié)直腸癌細(xì)胞系，來模擬典型的人類腫瘤探索vemurafenib藥理學(xué)特征。如圖17所示，當(dāng)這些細(xì)胞被用于異體移植模型時(shí)，隨著vemurafenib口服劑量的增加，最初引起腫瘤停滯（~100μM•小時(shí)），隨后引起腫瘤衰減（~300μM•小時(shí)及以上）。 圖17異體移植模型中的vemurafenib試驗(yàn)。BRAFV600E突變?nèi)嗽唇Y(jié)直腸癌細(xì)胞系在免疫缺陷小鼠的側(cè)腹部生長(zhǎng)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150mm3的時(shí)候，利用填喂法進(jìn)行4星期3種vemurafenib濃度或者對(duì)照組口服給藥。出現(xiàn)了明顯的濃度依賴性腫瘤生長(zhǎng)抑制，進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估，圖表中給出了第7天的AUC曲線下面積。在300 μM•小時(shí)出現(xiàn)腫瘤衰退，這一結(jié)果確定了一個(gè)臨床前藥物利用閾值，用以指導(dǎo)臨床試驗(yàn)。 Vemurafenib結(jié)合的結(jié)構(gòu)分析 共結(jié)晶化研究可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于vemurafenib結(jié)合的分析研究。Vemurafenib與BRAFV600E突變蛋白的共結(jié)晶化研究表明BRAF形成二聚體。共結(jié)晶化在vemurafenib的發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮重要的作用，使得以“錨定生長(zhǎng)”為原則的scaffold為基礎(chǔ)的方法應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)�！板^定生長(zhǎng)”方法使得特異性結(jié)合突變型原癌基因的新一代激酶抑制劑產(chǎn)生，并且引進(jìn)了一種新的激酶抑制劑類型作為工具化合物。 臨床藥理學(xué) 在最初的臨床試驗(yàn)開始前，要先研究一種診斷試劑，用以識(shí)別擁有BRAF原癌基因的黑色素瘤（見BOX1）。 一旦vemurafenib由于它的有利潛能、選擇性和藥學(xué)特性被選為臨床研發(fā)候選藥物，那么接踵而來的是一系列臨床前研究，用以指導(dǎo)預(yù)測(cè)它在人體的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)�；谶@些成功的毒性和安全藥理學(xué)研究，一項(xiàng)《新藥研發(fā)申請(qǐng)》于2006年秋天被FDA存檔。幾乎同時(shí)，Plexxikon公司和羅氏簽署了一項(xiàng)合作協(xié)議，共同進(jìn)行vemurafenib的臨床研究。 重構(gòu)研究。Vemurafenib最初的形式是膠囊式結(jié)晶粉末（并且添加幾種常用的藥物佐劑來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，提高生物利用度），可以通過口服給藥。這雖然適用于最初的臨床測(cè)試，但是不利于制造和貯存，同時(shí)晶體結(jié)構(gòu)證明，最高溶解度不穩(wěn)定。為了提高溶解度和穩(wěn)定性，羅氏將vemurafenib重制入一種稱為微沉淀散裝粉（microprecipitated bulk powder）的非結(jié)晶材料�；谝豁�(xiàng)健康受試者的藥代動(dòng)力學(xué)研究，微沉淀散裝粉制劑被證明，相對(duì)于晶體形式，在生物利用度上有6倍的增長(zhǎng)。 I期劑量擴(kuò)大試驗(yàn)。劑量擴(kuò)大I期安全性試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00405587)最初是用晶體粉末在一些學(xué)術(shù)醫(yī)院的實(shí)體腫瘤患者身上使用。由圖18所示，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，在最初形式的藥物利用中，患者血藥濃度達(dá)到~200μM•小時(shí)的平衡水平，這遠(yuǎn)低于臨床前腫瘤衰減的濃度閾值300μM•小時(shí)。但是，重構(gòu)的vemurafenib使得劑量增加試驗(yàn)重新啟動(dòng)，起始劑量為原晶體形式劑量水平的十分之一（也就是160mg，每天兩次）。一共6個(gè)臨床試驗(yàn)中心在招募富集患者群體，尤其是雙組織樣（也就是，用藥前和用藥中的樣品）都可以獲得的患者。由于對(duì)于新劑型藥品的延展性非常有信心，研究者當(dāng)時(shí)預(yù)測(cè)下一劑量水平240mg 每天兩次可以達(dá)到300μM•小時(shí)的閾值，從而在BRAF突變主導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的患者體內(nèi)首次看到腫瘤衰減。結(jié)果證明我們是正確的（圖18），從而提供了一個(gè)非常漂亮的轉(zhuǎn)化科學(xué)實(shí)例，由生化抑制，通過細(xì)胞水平到異體移植模型指導(dǎo)臨床試驗(yàn)。 圖18 在人血漿中vemurafenib利用度的藥代動(dòng)力學(xué)分析。a.最初的晶體形式是的藥物利用度達(dá)到了飽和。使得新劑型藥物迫在眉睫。在臨床前得到的300 μM•小時(shí)的腫瘤縮小劑量Y由虛線表示。b. vemurafenib重制后血藥濃度提高了六倍，并且沒有明顯的飽和現(xiàn)象。AUC：曲線下區(qū)域。 臨床有效性和安全性 黑色素瘤患者臨床試驗(yàn)。Plexxikon公司研究者與臨床研究者確定I期臨床試驗(yàn)中有很大的機(jī)會(huì)為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者提供良好的臨床治療。所以，公司招募了32個(gè)患者進(jìn)行黑色素瘤擴(kuò)展試驗(yàn)，以960mg 每天兩次的劑量（ClinicalTrials.gov identifier: NCT00405587）。達(dá)到了空前的81%的未證實(shí)總體應(yīng)答率，而且，在腫瘤應(yīng)答時(shí)間和延長(zhǎng)總體存活率方面，960mg 每天兩次服藥的患者與BRAF野生型患者或者是服用輔助治療劑量的患者相比，其優(yōu)勢(shì)都是非常喜人的。基于這些，Plexxikon公司和羅氏的研究者都自信地認(rèn)為可以開始隨機(jī)臨床III期試驗(yàn)，以及一個(gè)臨床II期試驗(yàn)和其他I期試驗(yàn)研究。 黑色素瘤臨床II期試驗(yàn)的應(yīng)答結(jié)果 臨床II期試驗(yàn)的目標(biāo)是在更多的擁有BRAF突變激活并且經(jīng)過多種治療的黑色素瘤患者身上試驗(yàn)vemurafenib的有效性和安全性（ClinicalTrials.gov identifier: NCT00949702）。一共招募了132名患者，包括10名BRAFV600K突變患者（其余為BRAFV600E突變患者，見BOX1）。一項(xiàng)獨(dú)立檢查評(píng)估的結(jié)果顯示，確認(rèn)的總體應(yīng)答率為53%，包括6%的完全應(yīng)答。應(yīng)答時(shí)間中值為6.7個(gè)月。 有趣的是，一些臨床應(yīng)答是在患者服用vemurafenib大于6個(gè)月是被記錄。最重要的是，隨著這些患者被追蹤超過一年后，總體存活的中值為15.9個(gè)月，這與之前在轉(zhuǎn)移性黑色瘤患者的6~10個(gè)月相比具有很明顯地優(yōu)勢(shì)。 關(guān)鍵的臨床III期試驗(yàn) 關(guān)鍵性III期試驗(yàn)是針對(duì)大群體（675名患者）、隨機(jī)的、嚴(yán)格控制的試驗(yàn)，用以評(píng)估vemurafenib作為單治療藥物，與達(dá)卡巴嗪相比，作用于不可切除的IIIc或IV期未經(jīng)治療的黑色素瘤患者（都是BRAFV600E突變陽性）的有效性和安全性（ClinicalTrials.gov identifier: NCT01006980）。 為了最少化患者對(duì)于對(duì)照組達(dá)卡巴嗪的應(yīng)用，F(xiàn)DA建議III期統(tǒng)計(jì)分析計(jì)劃修訂為假定vemurafenib有更大的臨床優(yōu)勢(shì)。臨床III期試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析顯示，與達(dá)卡巴嗪組相比，vemurafenib組患者在存活時(shí)間上具有臨床上和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著提高（P <0.0001），并且在死亡率上也有63%的降低（風(fēng)險(xiǎn)比: 0.37）。 臨床藥效學(xué) 在臨床I期試驗(yàn)中，一部分黑色素瘤患者有成對(duì)活組織樣品：一個(gè)是首次vemurafenib之前的樣品，一個(gè)是用藥14天后的樣品。這些樣品通過檢測(cè)ERK磷酸化來看BRAF通路，同時(shí)進(jìn)行Ki67增殖染色和PET成像。所有可評(píng)估患者的應(yīng)答都記錄在冊(cè)，并且顯著應(yīng)答的案例在圖19中顯示。結(jié)果顯示：腫瘤衰減需要接近全部的此信號(hào)通路的抑制。初次試驗(yàn)是研究100mg•小時(shí)劑量下的藥代動(dòng)力學(xué)，如圖17，這一劑量下腫瘤處于停滯期，起初我們非常鼓舞地發(fā)現(xiàn)14天給藥后，pERK和Ki67染色有大于50%的降低，但是，并沒有出現(xiàn)腫瘤衰減，無惡化存活與對(duì)照組相比也基本沒有差異。 圖 19 服用vemurafenib患者的PET成像。PET成像可視化觀察18F-脫氧葡萄糖的攝取。a和b為兩個(gè)患者，左側(cè)為開始治療前，右側(cè)為用藥2周后。PET結(jié)果顯示，vemurafenib給藥后腫瘤代謝明顯阻滯。 但是，利用重構(gòu)的vemurafenib后大大提高了利用率。從這些更高利用率患者樣品中達(dá)到的數(shù)據(jù)結(jié)果相當(dāng)喜人：pERK和Ki67染色有大于80%的降低。圖20將腫瘤衰減比作pERK和Ki67染色的藥效終點(diǎn)降低。與更高的利用度和隨后的通路抑制相一致，在腫瘤暴露于這些更高的藥物劑量后，頻繁地出現(xiàn)了腫瘤衰減。 圖20 臨床I期的成對(duì)活組織樣品數(shù)據(jù)。來自于I期試驗(yàn)的患者成對(duì)活組織樣品分析。一個(gè)樣品為給藥前的，一個(gè)為給藥2周后的。進(jìn)行pERK和Ki67的免疫組化染色。Y軸表示的是這兩個(gè)標(biāo)記物的抑制百分比，x軸表示的是vemurafenib的血漿水平。圖表顯示，即使是藥物濃度不到300 μM•小時(shí)的患者，這兩項(xiàng)指標(biāo)的抑制率也>50%，籃圈內(nèi)的患者是沒有出現(xiàn)腫瘤衰減的。插圖顯示了一個(gè)代表性的案例，一名患者在用藥14天后出現(xiàn)了54%的腫瘤縮減，其染色結(jié)果如圖。 由BRAF抑制劑揭露的RAF新生物特性 隨著這些具有前景的臨床結(jié)果的公布，Plexxikon公司的化合物對(duì)學(xué)術(shù)研究者們開放，從而可以開始更細(xì)致地研究BRAF抑制的重要作用。這些學(xué)術(shù)研究包括：探索BRAF突變腫瘤中的抑制機(jī)理和描述vemurafenib耐受的機(jī)理。他們也研究在BRAF突變?nèi)狈Φ募?xì)胞中RAF抑制的效用。在過去的兩年中，超過200篇描述vemurafenib藥效的文章被發(fā)表。 許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證了vemurafenib選擇性地抑制多個(gè)BRAF突變的黑色素瘤、甲狀腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中MAPK信號(hào)通路。對(duì)增殖的抑制和對(duì)凋亡的誘導(dǎo)在細(xì)胞系間具有相當(dāng)大差異。 耐受機(jī)理。由于黑色素瘤細(xì)胞系對(duì)于vemurafenib的敏感度有很大差異，固有耐受的原因在某些研究中被提到。通過PTEN的缺失而引起的PI3K通路的激活發(fā)揮重要的作用，但并不能總是很好的預(yù)測(cè)vemurafenib的藥物敏感性。還有除了MAPK和PI3K通路之外的因子參與其中。其中一個(gè)因子已經(jīng)被識(shí)別：通過眼癌蛋白腫瘤抑制子的細(xì)胞周期調(diào)控。 最近，在BRAFV600E結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)固有耐受的重要原因：EGFR的激活。因此vemurafenib和EGFR拮抗劑的聯(lián)合應(yīng)用提供了一個(gè)BRAF突變結(jié)直腸癌治療的新方案。 大多數(shù)黑色素瘤患者在vemurafenib治療期間會(huì)有一些程度的腫瘤衰減，但是通常在一年內(nèi)就會(huì)復(fù)發(fā)。這暗示，BRAF抑制會(huì)出現(xiàn)獲得性耐受，很多不同的機(jī)理被闡述�？赡苁讉�(gè)被提議的機(jī)理就包括CRAF的表達(dá)。 在大量臨床前和臨床試驗(yàn)中被記錄的第二個(gè)機(jī)理就包括NRAS的激活，NRAS是RAS原癌基因的同系物，并在一些原代黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)。而且，通過例如PDGFR和IGF1R等生長(zhǎng)因子受體的上調(diào)也被提到。BRAF的擴(kuò)增也可能發(fā)生，這一機(jī)理也用以解釋MEK抑制劑耐受。最近研究中還提到了HGF和其受體MET也參與vemurafenib的耐藥性。 MAPK激活的機(jī)理。由于vemurafenib的臨床成功性，在2010年，對(duì)于MAPK通路激活的矛盾機(jī)理在一系列文章中被提到。這些研究顯示，MAPK通路的激活需要上游生長(zhǎng)因子通路的激活或者是RAS突變。如今，已普遍認(rèn)為，RAF酶的二聚化是上游信號(hào)通路活化的決定因素。 未來方向 Vemurafenib的研發(fā)史充滿了啟示、成功和希望。但是，雖然有顯著的腫瘤衰減和無惡化生存率和總生存數(shù)上的增加，但如今，只有非常少的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者被vemurafenib治愈。BRAF抑制，尤其是vemurafenib對(duì)于BRAF的抑制，給轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者提供了非常重要的治療選擇。其中應(yīng)該被探索的想法是，在非晚期黑色素瘤患者身上進(jìn)行vemurafenib的試驗(yàn)，或者是輔助試驗(yàn)。此外，也期望進(jìn)行其他BRAF突變腫瘤類型的研究以及與其他治療進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用。 基于之前進(jìn)行的耐藥性機(jī)理研究以及BRAF突變腫瘤的基本生物特性，許多不同的組合策略被推薦。由于MAPK通路經(jīng)常在復(fù)發(fā)腫瘤中被重新激活，一個(gè)vemurafenib和MEK抑制劑的聯(lián)合用藥被批準(zhǔn)，并且此類的研究也正在進(jìn)行。此外，黑色素瘤和其他腫瘤對(duì)于PI3K通路的共依賴也建議我們將vemurafenib與PI3K、AKT或者mTOR的抑制劑聯(lián)合用藥。 并且與其他的臨床試驗(yàn)相比，由vemurafenib研發(fā)中獲得的知識(shí)可以開拓用于下一代BRAF抑制劑的研發(fā)。 總的來說，我們相信vemurafenib的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)過程可以給將來的個(gè)性化藥物提供處方。其中材料包括：一個(gè)驅(qū)動(dòng)癌基因，一個(gè)可以識(shí)別癌基因患者的診斷方法；一個(gè)可以特異地有效地抑制這一癌基因功能的藥物。未來的預(yù)想是：癌癥首先被驅(qū)動(dòng)基因注解，然后一個(gè)針對(duì)這些關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)的藥物組合藥方被研發(fā)出來，從而治療患者。 BOX1 BRAF診斷發(fā)展 認(rèn)識(shí)到了準(zhǔn)確識(shí)別攜帶BRAF黑色素瘤患者的重要性，Plexxikon公司于2005年與羅氏分子系統(tǒng)合作（vemurafenib臨床試驗(yàn)開始前一年）。 為了獲得一個(gè)穩(wěn)定可再生的試劑盒，要克服多重困難。首先，福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品（FFPET）可以很好地保存不同質(zhì)量和年齡的組織，也可以保存DNA聚合酶的內(nèi)生性抑制劑，這可能干擾結(jié)果。尤其對(duì)于黑色素瘤樣品，內(nèi)源性的黑色素成為了一個(gè)障礙。因此，提取FFPET中的DNA需要相當(dāng)大的最優(yōu)化。PCR試劑的產(chǎn)生以及PCR分析的配置和最優(yōu)化都需要足夠的資源。而且，F(xiàn)FPET樣品由臨床試驗(yàn)地點(diǎn)（或者是患者最初診斷的診所）向分析實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸問題，以及及時(shí)的與臨床研究員交流結(jié)果，都面臨高度的時(shí)間敏感性考慮。 羅氏分子系統(tǒng)的科學(xué)家們發(fā)展了一種實(shí)時(shí)PCR分析來檢測(cè)BRAFV600E突變型。這種分析可以直接檢測(cè)FFPET中的BRAF突變。這一技術(shù)包括一對(duì)互補(bǔ)的引物來擴(kuò)增V600密碼子周圍的BRAF序列，以及兩個(gè)熒光標(biāo)記的探針。一個(gè)探針識(shí)別野生型DNA序列GTG，另一個(gè)識(shí)別突變型DNA序列GAG；每一個(gè)探針由不同的熒光標(biāo)記。探針包括一個(gè)熒光標(biāo)記和一個(gè)淬滅劑。如果探針與DNA序列正確地結(jié)合，則PCR聚合酶的核酸酶活性可以切斷淬滅劑，從而保持親和探針的熒光強(qiáng)度。由于野生型和突變型的探針在同一個(gè)試劑中，每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)都需要一個(gè)同進(jìn)程對(duì)照。 BRAF試劑盒也有分析性能。輸入125ng包括5%突變的基因組DNA（由5 μm FFPET中獲得）可以產(chǎn)生>96%的命中率。它的特異性和敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的測(cè)序。有趣的是，雖然這一試劑盒設(shè)計(jì)用于特異性地檢測(cè)V600E突變型，它也會(huì)偶然地檢測(cè)V600K或者是更稀有的V600D突變型。 診斷試劑的研發(fā)基本與vemurafenib的臨床研發(fā)同步。 隨著原型診斷試劑盒與臨床I期試驗(yàn)同步研發(fā)，這一試劑盒被用作臨床II期和III期的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)入臨床II期和III期的樣本也使得這一診斷試劑盒獲得批準(zhǔn)。從BRAF試劑盒中獲得的數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序相比較，有差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行更為敏感的深度測(cè)序分析（即454測(cè)序）。綜合數(shù)據(jù)在2011年5月提交到US監(jiān)管當(dāng)局，這一診斷試劑盒在2011年8月獲得了市場(chǎng)批準(zhǔn)，與vemurafenib的批準(zhǔn)同期獲得。 宋巧玲 編譯 吳慧 校譯自 《Vemurafenib: the first drug approved for BRAF-mutant cancer》 |
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