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天使1Q86之城新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
酶切連接
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第一步：從測(cè)序成功的質(zhì)粒上酶切出目的基因，凝膠回收。 第二步：把質(zhì)粒35S-GFP-1300酶切出同樣的酶切位點(diǎn)，凝膠回收。 第三部：用高效連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5a 結(jié)果：轉(zhuǎn)化效率很高，但是沒(méi)有陽(yáng)性克隆。 正常來(lái)說(shuō)只要是陽(yáng)性克隆就應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題的，但是···為什么總是不對(duì)呢？ 最近做的甚是苦逼，諸位大俠幫幫小弟吧。 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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酶切時(shí)間只是一個(gè)方面。 酶切設(shè)計(jì)時(shí)需要明確：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug質(zhì)粒DNA就足夠了），DNA的質(zhì)量（一般，按照質(zhì)粒試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的質(zhì)粒還是可以的，但如果培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或制備質(zhì)粒時(shí)不規(guī)范，容易導(dǎo)致質(zhì)粒酶切不完全），限制性 內(nèi)切酶的用量。 從你描述的情況來(lái)看，可能是你的質(zhì)粒DNA酶切不完全（即存在大量的單酶切產(chǎn)物，而單酶切載體是最容易自連，而形成背景克�。�。驗(yàn)證酶切是否徹底的一個(gè)方法就是設(shè)計(jì)一個(gè)載體的自連實(shí)驗(yàn)（即在連接反應(yīng)中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的載體處理得不好。 其實(shí)對(duì)你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行量化是提高克隆效率的一個(gè)很重要的手段，包括：對(duì)質(zhì)粒定量（濃度，純度等），精確計(jì)算酶切所需的酶等。建議你借助doulbe digeston designer進(jìn)行雙酶切設(shè)計(jì)。你可以在小木蟲(chóng)上搜到其鏈接。對(duì)初學(xué)者很有幫助。 |
5樓2013-01-09 21:57:15
hubohuna
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2樓2013-01-09 20:03:55
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3樓2013-01-09 20:38:45
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4樓2013-01-09 20:56:12
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