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天使1Q86之城新蟲 (初入文壇)
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[求助]
酶切連接
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第一步：從測序成功的質(zhì)粒上酶切出目的基因，凝膠回收。 第二步：把質(zhì)粒35S-GFP-1300酶切出同樣的酶切位點，凝膠回收。 第三部：用高效連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5a 結(jié)果：轉(zhuǎn)化效率很高，但是沒有陽性克隆。 正常來說只要是陽性克隆就應(yīng)該沒有問題的，但是···為什么總是不對呢？ 最近做的甚是苦逼，諸位大俠幫幫小弟吧。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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酶切時間只是一個方面。 酶切設(shè)計時需要明確：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug質(zhì)粒DNA就足夠了），DNA的質(zhì)量（一般，按照質(zhì)粒試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的質(zhì)粒還是可以的，但如果培養(yǎng)時間過長，或制備質(zhì)粒時不規(guī)范，容易導(dǎo)致質(zhì)粒酶切不完全），限制性 內(nèi)切酶的用量。 從你描述的情況來看，可能是你的質(zhì)粒DNA酶切不完全（即存在大量的單酶切產(chǎn)物，而單酶切載體是最容易自連，而形成背景克隆）。驗證酶切是否徹底的一個方法就是設(shè)計一個載體的自連實驗（即在連接反應(yīng)中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的載體處理得不好。 其實對你的實驗設(shè)計進(jìn)行量化是提高克隆效率的一個很重要的手段，包括：對質(zhì)粒定量（濃度，純度等），精確計算酶切所需的酶等。建議你借助doulbe digeston designer進(jìn)行雙酶切設(shè)計。你可以在小木蟲上搜到其鏈接。對初學(xué)者很有幫助。 |
5樓2013-01-09 21:57:15
cicelyzh
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10樓2013-01-10 17:14:52
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