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癡夢(mèng)瀟湘版主
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值得精讀的一篇國(guó)內(nèi)發(fā)表的Nature Chemical Biology 已有27人參與
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國(guó)內(nèi)參與單位：國(guó)家生命科學(xué)研究所、天津大學(xué) 這篇文章確證了死亡受體DR5作為抗腫瘤靶標(biāo)，并篩選出第一個(gè)小分子先導(dǎo)化合物，貢獻(xiàn)很大，篇幅較短，覆蓋當(dāng)代生物化學(xué)各種技術(shù)，非常值得精讀。文章內(nèi)容及背景大體如下： 細(xì)胞凋亡（apoptosis）有三條信號(hào)通路，即：死亡受體信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路，其中第一條為外源性信號(hào)通路（extrinsic pathway），后兩條為內(nèi)源性信號(hào)通路（intrinsic pathway）。 圖1. 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路 圖2. 死亡受體信號(hào)通路 死亡受體（death receptors）是一種跨膜蛋白，有TNF受體、FasL受體、DR三大類，其胞外區(qū)（extracellular domain）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，聚合形成同源三聚體。三聚體復(fù)合物通過其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain），與銜接蛋白（adaptor protein）FADD結(jié)合。FADD一種連接蛋白，C-端為死亡結(jié)構(gòu)域，N-端為死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death-effector domain），能夠與Caspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（death-inducing signaling complex，DISC）。 TNF：tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子 FasL：Fas ligand，F(xiàn)as抗原配體 TRAIL：tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 FADD：Fas-associated death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域 FasL受體被稱為Fas或CD95；TNF受體有兩種亞型即TNFR-1和TNFR-2，其中TNFR-1有FADD而TNFR-2沒有；DR有三種亞型，其中DR-3被稱為Apo-3，DR-4即TRAILR-1，DR-5即TRAILR-2。 Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶，全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵�；罨腃aspase-8可激活下游的Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，激活細(xì)胞凋亡下游信號(hào)通路。 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7的活性受到IAP家族蛋白（如XIAP、cIAP1、cIAP2）的抑制，而解除IAP的抑制依賴線粒體的凋亡信號(hào)Smac/Diablo。Smac能與IAP的Bir-結(jié)構(gòu)域結(jié)合，解除IAP對(duì)Caspase的抑制作用，并誘導(dǎo)IAP的降解。 IAP：inhibitor of apoptosis protein細(xì)胞凋亡抑制蛋白 Smac與IAP結(jié)合的關(guān)鍵是N-端的丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸四個(gè)氨基酸殘基，科學(xué)家已經(jīng)用肽模擬方法（peptido-mimetic approach）開發(fā)出小分子化合物，產(chǎn)生與Smac相似的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 研究人員篩選了200,000個(gè)化合物，尋找能與Smac模擬物（Smac mimetic, SM）產(chǎn)生協(xié)同作用的化合物（synergist），篩選用細(xì)胞為T98G細(xì)胞株（人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株）。初篩發(fā)現(xiàn)2,068化合物，隨后發(fā)現(xiàn)24個(gè)化合物能在15μΜ濃度顯著增強(qiáng)SM抑制腫瘤的活性。刪去細(xì)胞毒性大的，只剩下4個(gè)化合物，做dose-response分析，最終篩選出化合物A2C2作進(jìn)一步研究。 圖3. 發(fā)現(xiàn)死亡受體激動(dòng)劑 按照A2C2的結(jié)構(gòu)，研究人員合成了這一化合物，但奇怪的是合成出的化合物（記為A1）完全沒有活性，意味著A1與A2C2不是同一種物質(zhì)，問題出在哪呢？經(jīng)過大量NMR和LC/MS分析，確證A2C2實(shí)為三種重排產(chǎn)物（A1、C2、A2）的混合物，有活性的是A2+C2。隨后是一系列結(jié)構(gòu)修飾合成，發(fā)現(xiàn)化合物bioymifi有很好的活性，抑制腫瘤細(xì)胞不需要SM的協(xié)同作用，并且對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞株有抑制活性，下一步就是尋找bioymifi的作用靶點(diǎn)了。 在給予bioymifi和SM的同時(shí)，給予pan-caspase抑制劑Z-VAD（Z-VAD能抑制Caspase的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路），發(fā)現(xiàn)不能有效抑制腫瘤，這說明bioymifi激活了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。為了進(jìn)一步確定bioymifi作用于哪一條信號(hào)通路，研究人員使用siRNA分別沉默T98G細(xì)胞的Caspase-8和Caspase-9編碼區(qū)，最終確定bioymifi和SM抑制的是Caspase-8所在信號(hào)通路即外源凋亡信號(hào)通路。 與Caspase-8有關(guān)的死亡受體有Fas、TNFR-1、DR3、DR4、DR5等類型（注TNFR-2無FADD，參與NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不經(jīng)Caspase-8），bioymifi與那種死亡受體有關(guān)呢？通過RNAi篩選，沉默DR5基因，能夠逆轉(zhuǎn)bioymifi誘導(dǎo)的凋亡，并且bioymifi顯示出的結(jié)果與TRAIL（DR5的原始配體）一致。 隨后的免疫沉淀（immunoprecipitate）和免疫印跡分析（western blot analysis）證實(shí)，bioymifi或TRAIL處理后的T98G細(xì)胞中，均檢測(cè)到FADD、TRADD、RIPK1等與DISC相關(guān)的蛋白，而對(duì)照細(xì)胞檢測(cè)不到。 另一方面，給予TRAIL的同時(shí)給予TRAIL抗體，TRAIL失去誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。給予TRAIL的同時(shí)給予bioymifi，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力無明顯差異。沉默用siRNA沉默TRAIL基因，不影響bioymifi誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。 為了進(jìn)一步確證bioymifi的作用靶點(diǎn)，研究人員僅含胞外區(qū)的DR4與DR5，發(fā)現(xiàn)bioymifi與DR5的親和力較好，Kd值在1.2μΜ，與DR4無親和力。DSD電泳、分子排阻色譜等檢測(cè)到高分子量的聚合物，證明bioymifi能誘導(dǎo)DR5的聚合，細(xì)胞成像也觀察到了明顯的foci 結(jié)構(gòu)，DR4無這些現(xiàn)象。 綜上，發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)選擇性小分子DR5激動(dòng)劑。 Reference: Small-molecule activation of the TRAIL receptor DR5 in human cancer cells. Nature Chemical Biology. doi:10.1038/nchembio.1153. 文獻(xiàn)下載： |
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2013-01-11 20:33:03, 801.94 K
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