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cai3110274木蟲 (職業(yè)作家)
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[求助]
real-time PCR求助
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最近做real-time PCR，遇到一些問題 ，希望會(huì)的蟲友幫忙解答一下 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2大于0.999，但是曲線斜率偏小，擴(kuò)增效率大于100%， 融解曲線情況良好 沒有引物二聚體，這是為什么呢 ？ 2. 還有就是在陰性對(duì)照中也會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增，但都在CT大于35（目的片段CT在15~25之間），是不是因?yàn)檫@個(gè)擴(kuò)增導(dǎo)致了 擴(kuò)增效率的增大？該怎么去除呢？ 3. 我看到有人說擴(kuò)增效率在 90~110之間都可以接受，陰性對(duì)照在35循環(huán)后出現(xiàn)擴(kuò)增可以忽略不計(jì)，不知道有什么參考文獻(xiàn)可以給出嗎？ 希望知道的蟲友可以不吝賜教，非常感謝！ |
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cicelyzh
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8樓2013-01-13 14:11:56
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【答案】應(yīng)助回帖
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cai3110274: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 原來40循環(huán) 現(xiàn)在準(zhǔn)備降到35試試看 呵呵 2013-01-15 10:29:33
cai3110274: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 原來40循環(huán) 現(xiàn)在準(zhǔn)備降到35試試看 呵呵 2013-01-15 10:29:33
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DNase要用RNase-free的，理論上消化過程中不會(huì)降解RNA。消化時(shí)間根據(jù)買的酶稍有些不同，時(shí)間和溫度按照說明做就可以了。酶的作用效果也和樣品中DNA含量有關(guān)。因?yàn)槟愕呢?fù)對(duì)照有擴(kuò)增，如果不是引物引起的話，可能是DNA消化時(shí)稍微欠缺，稍微延長一點(diǎn)就可以了。 |
14樓2013-01-14 15:16:44
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小丹木木: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-01-15 13:52:41
小丹木木: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-01-15 13:52:41
| 可能你的循環(huán)數(shù)有點(diǎn)多了 退火時(shí)間可以適當(dāng)降低 |
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cai311027415樓2013-01-14 16:07:35
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10樓2013-01-14 07:54:18
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