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求大神啊，雙交換，篩突變株的時候出問題了。
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要敲掉目的菌株染色體的一個基因。。。 用另外一個外源基因替換它。。。構建了一個敲出載體。（該載體，包含了要敲除的目的菌株基因的上下游臂，然后把這個外源基因和篩選標記連到上下游臂間，進行雙交換）載體轉(zhuǎn)化到特定的大腸中。 采用接合轉(zhuǎn)移，做雙交換，但長出來的菌，進行篩選的時候，都是大腸，沒有我那株菌，到底是怎么回事呢。。。（做接合的時候，我在平板上有加一種可以殺大腸的，但大腸怎么還長呢，我有做對照，大腸在那種東西下是長不了的） |
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cicelyzh
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2樓2013-01-15 08:37:54
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【答案】應助回帖
★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵積極幫助解決問題 2013-01-16 13:42:37
gyesang: 金幣+2, 鼓勵積極幫助解決問題 2013-01-16 13:42:37
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我轉(zhuǎn)的是藍藻，克隆是綠的。所以不會發(fā)生你說的情況。不知道對你的有沒有幫助。 大致的方法如下： 把受體菌、含有克隆載體的e.coli，還有一個帶有helper質(zhì)粒的e.coli混起來。先是把helper菌和有載體的菌離心，用無抗生素的LB重懸，濃縮5-10倍，1:1混合。然后把生長在對數(shù)期的受體細胞也離心，重懸在BG-11培養(yǎng)液里，稀釋若干梯度。最后把混合的菌液與受體細胞1:1混起來，30度1-2小時，然后涂在有微孔濾膜的平板（無抗生素）上培養(yǎng)1-2天，然后把濾膜轉(zhuǎn)到抗性平板上篩選。 |
6樓2013-01-15 15:53:49
7樓2013-01-16 09:30:21
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10樓2013-01-16 09:45:45
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