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求大神啊，雙交換，篩突變株的時(shí)候出問題了。
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要敲掉目的菌株染色體的一個(gè)基因。。。 用另外一個(gè)外源基因替換它。。。構(gòu)建了一個(gè)敲出載體。（該載體，包含了要敲除的目的菌株基因的上下游臂，然后把這個(gè)外源基因和篩選標(biāo)記連到上下游臂間，進(jìn)行雙交換）載體轉(zhuǎn)化到特定的大腸中。 采用接合轉(zhuǎn)移，做雙交換，但長(zhǎng)出來的菌，進(jìn)行篩選的時(shí)候，都是大腸，沒有我那株菌，到底是怎么回事呢。。。（做接合的時(shí)候，我在平板上有加一種可以殺大腸的，但大腸怎么還長(zhǎng)呢，我有做對(duì)照，大腸在那種東西下是長(zhǎng)不了的） |
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2樓2013-01-15 08:37:54
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4樓2013-01-15 11:29:09
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)積極幫助解決問題 2013-01-16 13:42:37
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)積極幫助解決問題 2013-01-16 13:42:37
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我轉(zhuǎn)的是藍(lán)藻，克隆是綠的。所以不會(huì)發(fā)生你說的情況。不知道對(duì)你的有沒有幫助。 大致的方法如下： 把受體菌、含有克隆載體的e.coli，還有一個(gè)帶有helper質(zhì)粒的e.coli混起來。先是把helper菌和有載體的菌離心，用無(wú)抗生素的LB重懸，濃縮5-10倍，1:1混合。然后把生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期的受體細(xì)胞也離心，重懸在BG-11培養(yǎng)液里，稀釋若干梯度。最后把混合的菌液與受體細(xì)胞1:1混起來，30度1-2小時(shí)，然后涂在有微孔濾膜的平板（無(wú)抗生素）上培養(yǎng)1-2天，然后把濾膜轉(zhuǎn)到抗性平板上篩選。 |
6樓2013-01-15 15:53:49
7樓2013-01-16 09:30:21
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8樓2013-01-16 09:33:12
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10樓2013-01-16 09:45:45
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