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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
還是QPCR
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大家好！我現(xiàn)在剛接觸QPCR，看了大量資料，還有一點(diǎn)不是很清楚，還請(qǐng)高手指點(diǎn)啊。。。。 優(yōu)化QPCR條件的時(shí)候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴(kuò)增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過(guò)程。可是問(wèn)題是，我要做的基因有10幾個(gè)，那么是不是每個(gè)基因都要做5個(gè)濃度梯度擴(kuò)增效率曲線呢，這樣一來(lái)昂貴的進(jìn)口試劑用的超級(jí)快啊，有點(diǎn)扛不牢啊，想問(wèn)說(shuō)是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻(xiàn)發(fā)表過(guò)的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴(kuò)增效率曲線是不是就不用做了呢？ 不知道大家是怎么個(gè)程序呀？ |
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cicelyzh
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6樓2013-01-25 10:54:27
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 優(yōu)化條件時(shí)首先要看熔解曲線是否是單峰。多峰的話說(shuō)明有非特異擴(kuò)增或者引物二聚體，這樣肯定不適宜做定量的。擴(kuò)增效率也是需要測(cè)的。如果你用了別人發(fā)表的引物采取不同的退火溫度，擴(kuò)增效率在不同的溫度下可能會(huì)有不同，所以不能省略擴(kuò)增效率曲線。基因多也是沒有辦法的，每對(duì)引物都要做擴(kuò)增效率曲線的。 |
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shiliyusly2樓2013-01-25 08:16:45
shiliyusly
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我昨天做了2個(gè)基因的擴(kuò)增效率曲線，ACT(內(nèi)標(biāo)基因)，F(xiàn)3'H，這2個(gè)基因都有點(diǎn)小峰，ACT效率有140%，F(xiàn)3'H只有80%。唉，這2個(gè)基因都是直接拿別人文獻(xiàn)用的，卻是這個(gè)效果。 3樓2013-01-25 09:38:00
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-25 13:17:03
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-25 13:17:03
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優(yōu)化QPCR條件的時(shí)候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴(kuò)增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過(guò)程。 是的。 可是問(wèn)題是，我要做的基因有10幾個(gè)，那么是不是每個(gè)基因都要做5個(gè)濃度梯度擴(kuò)增效率曲線呢，這樣一來(lái)昂貴的進(jìn)口試劑用的超級(jí)快啊，有點(diǎn)扛不牢啊， 每個(gè)基因必須做梯度做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括你的基因和內(nèi)參基因的，這些基因或許可用同一個(gè)內(nèi)參（具體咨詢你們領(lǐng)域的鄉(xiāng)親們需要） 想問(wèn)說(shuō)是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻(xiàn)發(fā)表過(guò)的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴(kuò)增效率曲線是不是就不用做了呢？ 還是要做，不同機(jī)器，不同公司的CHMICAL都有差異。 |
4樓2013-01-25 10:15:58
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