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shiliyusly新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
還是QPCR
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大家好！我現(xiàn)在剛接觸QPCR，看了大量資料，還有一點(diǎn)不是很清楚，還請(qǐng)高手指點(diǎn)啊。。。。 優(yōu)化QPCR條件的時(shí)候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴(kuò)增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過(guò)程�？墒菃�(wèn)題是，我要做的基因有10幾個(gè)，那么是不是每個(gè)基因都要做5個(gè)濃度梯度擴(kuò)增效率曲線呢，這樣一來(lái)昂貴的進(jìn)口試劑用的超級(jí)快啊，有點(diǎn)扛不牢啊，想問(wèn)說(shuō)是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻(xiàn)發(fā)表過(guò)的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴(kuò)增效率曲線是不是就不用做了呢？ 不知道大家是怎么個(gè)程序呀？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 優(yōu)化條件時(shí)首先要看熔解曲線是否是單峰。多峰的話說(shuō)明有非特異擴(kuò)增或者引物二聚體，這樣肯定不適宜做定量的。擴(kuò)增效率也是需要測(cè)的。如果你用了別人發(fā)表的引物采取不同的退火溫度，擴(kuò)增效率在不同的溫度下可能會(huì)有不同，所以不能省略擴(kuò)增效率曲線�；蚨嘁彩菦](méi)有辦法的，每對(duì)引物都要做擴(kuò)增效率曲線的。 |
shiliyusly2樓2013-01-25 08:16:45
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我昨天做了2個(gè)基因的擴(kuò)增效率曲線，ACT(內(nèi)標(biāo)基因)，F(xiàn)3'H，這2個(gè)基因都有點(diǎn)小峰，ACT效率有140%，F(xiàn)3'H只有80%。唉，這2個(gè)基因都是直接拿別人文獻(xiàn)用的，卻是這個(gè)效果。 3樓2013-01-25 09:38:00
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-25 13:17:03
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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優(yōu)化QPCR條件的時(shí)候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴(kuò)增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過(guò)程。 是的。 可是問(wèn)題是，我要做的基因有10幾個(gè)，那么是不是每個(gè)基因都要做5個(gè)濃度梯度擴(kuò)增效率曲線呢，這樣一來(lái)昂貴的進(jìn)口試劑用的超級(jí)快啊，有點(diǎn)扛不牢啊， 每個(gè)基因必須做梯度做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括你的基因和內(nèi)參基因的，這些基因或許可用同一個(gè)內(nèi)參（具體咨詢(xún)你們領(lǐng)域的鄉(xiāng)親們需要） 想問(wèn)說(shuō)是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻(xiàn)發(fā)表過(guò)的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴(kuò)增效率曲線是不是就不用做了呢？ 還是要做，不同機(jī)器，不同公司的CHMICAL都有差異。 |
4樓2013-01-25 10:15:58
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5樓2013-01-25 10:29:39
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9樓2013-01-25 13:18:47
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shiliyusly: 金幣+2, ★有幫助 2013-01-25 16:01:47
shiliyusly: 金幣+2, ★有幫助 2013-01-25 16:01:47
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擴(kuò)增效率100%是保證含量與CT之間的關(guān)系成2的冪，也是用CT來(lái)衡量模板含量的理論依據(jù)，同時(shí)也測(cè)定了模板量與CT符合這個(gè)關(guān)系的范圍，所以說(shuō)做定量這個(gè)是應(yīng)該做的。擴(kuò)增效率太高或者太低都說(shuō)明2^（-CT）值已經(jīng)不能很好的衡量模板量。這個(gè)從計(jì)算已經(jīng)出現(xiàn)了偏差，也就是說(shuō)樣品之間相差1CT，表達(dá)量不是成2倍關(guān)系。從理論上和實(shí)際上都說(shuō)不過(guò)去的吧。 至于提到的內(nèi)參CT值一致，這個(gè)則說(shuō)明樣品的內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定，內(nèi)參實(shí)際上就是要起到這個(gè)作用的。內(nèi)參CT一致只能說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄時(shí)樣品定量準(zhǔn)確，這個(gè)內(nèi)參基因選取是很適當(dāng)?shù)�。這個(gè)對(duì)定量來(lái)說(shuō)當(dāng)然是很好的，但是這并不能取代做擴(kuò)增效率。 |
10樓2013-01-25 14:09:03
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