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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 還是QPCR
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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
還是QPCR
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大家好！我現(xiàn)在剛接觸QPCR，看了大量資料，還有一點不是很清楚，還請高手指點啊。。。。 優(yōu)化QPCR條件的時候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過程�？墒菃栴}是，我要做的基因有10幾個，那么是不是每個基因都要做5個濃度梯度擴增效率曲線呢，這樣一來昂貴的進口試劑用的超級快啊，有點扛不牢啊，想問說是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻發(fā)表過的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴增效率曲線是不是就不用做了呢？ 不知道大家是怎么個程序呀？ |
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shiliyusly
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8樓2013-01-25 13:16:47
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| 優(yōu)化條件時首先要看熔解曲線是否是單峰。多峰的話說明有非特異擴增或者引物二聚體，這樣肯定不適宜做定量的。擴增效率也是需要測的。如果你用了別人發(fā)表的引物采取不同的退火溫度，擴增效率在不同的溫度下可能會有不同，所以不能省略擴增效率曲線�；蚨嘁彩菦]有辦法的，每對引物都要做擴增效率曲線的。 |
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shiliyusly2樓2013-01-25 08:16:45
shiliyusly
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我昨天做了2個基因的擴增效率曲線，ACT(內標基因)，F(xiàn)3'H，這2個基因都有點小峰，ACT效率有140%，F(xiàn)3'H只有80%。唉，這2個基因都是直接拿別人文獻用的，卻是這個效果。 3樓2013-01-25 09:38:00
chenguestc
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優(yōu)化QPCR條件的時候，要看溶解曲線是不是單峰，還要看擴增效率是否在90%-110%，最后跑電泳看是否是自己要的條帶，這是完整的過程。 是的。 可是問題是，我要做的基因有10幾個，那么是不是每個基因都要做5個濃度梯度擴增效率曲線呢，這樣一來昂貴的進口試劑用的超級快啊，有點扛不牢啊， 每個基因必須做梯度做一個標準曲線，包括你的基因和內參基因的，這些基因或許可用同一個內參（具體咨詢你們領域的鄉(xiāng)親們需要） 想問說是不是溶解曲線好的并且是用的別人文獻發(fā)表過的引物（但是退火溫度可能不一樣），擴增效率曲線是不是就不用做了呢？ 還是要做，不同機器，不同公司的CHMICAL都有差異。 |
4樓2013-01-25 10:15:58
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