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dorecnu木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
挽救一個(gè)被錯(cuò)誤操作的乙醇沉淀實(shí)驗(yàn)
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背景：雙酶切后準(zhǔn)備酚氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮DNA. 樣品比較珍貴不能重新制備樣品。 錯(cuò)誤：忘記了氯仿抽提步驟，在DNA溶液中加入了乙酸鈉。 問(wèn)題：1.加入乙酸鈉后是否可重復(fù)酚氯仿抽提步驟？ 2.如不能，將錯(cuò)就錯(cuò)，繼續(xù)乙醇沉淀。大量的蛋白也會(huì)被沉淀下來(lái)，會(huì)不會(huì)影響下一步DNA電泳。（制備的DNA準(zhǔn)備用于southernblot 實(shí)驗(yàn)） 自己想的解決辦法： 1.將已加入乙酸的DNA溶液繼續(xù)酚氯仿抽提，后乙醇沉淀。 這個(gè)方案的風(fēng)險(xiǎn)在于，高鹽濃度下酚氯仿抽提會(huì)不會(huì)DNA也隨之被抽走。因?yàn)槲野l(fā)現(xiàn)乙酸鈉是可以溶解于酚氯仿溶液中的。 2.將錯(cuò)就錯(cuò)的繼續(xù)乙醇沉淀后，將乙醇、蛋白沉淀重新溶解于水中。重復(fù)酚氯仿抽提乙醇沉淀步驟，重新濃縮DNA。 該方案的風(fēng)險(xiǎn)在于反復(fù)沉淀可能造成DNA的大量損失。 請(qǐng)問(wèn)各位木蟲(chóng)，有沒(méi)有遇到相似的問(wèn)題？能否支點(diǎn)招？ 在線等！ 謝謝大家。 [ Last edited by dorecnu on 2013-1-28 at 16:35 ] |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dorecnu: 金幣+1, ★有幫助, 謝謝回復(fù)。我試過(guò)了，高鹽濃度下dna回收率會(huì)降低60%以上；另外乙酸鈉是可以溶解在酚氯仿中的，置于和水的分配比例不知道。比較好的解決方案是使用PCR片段回收試劑盒除鹽，除蛋白后再用乙醇沉底濃縮一次。 2013-01-29 20:47:48
dorecnu: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-29 21:30:46
kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 21:49:50
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| 我認(rèn)為你直接用酚氯仿抽蛋白是沒(méi)有問(wèn)題的。DNA是不溶于有機(jī)相的，鹽好像應(yīng)該在水相里吧，加了鹽DNA也是在水相里，用乙醇或者異丙醇才會(huì)沉淀。 |
2樓2013-01-29 01:31:04
bubble1220
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dorecnu: 金幣+2, ★★★很有幫助, 抽提是為了除去體系中的蛋白。乙醇沉淀對(duì)dna的回收沒(méi)有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我覺(jué)得會(huì)比試劑盒高。試劑盒的問(wèn)題是有回收片段的偏好性，效率因試劑盒廠家不同波動(dòng)較大，另外洗脫體積往往較大；優(yōu)點(diǎn)是除鹽，除蛋白比較徹底，我嘗試使用天根Pcr片段純化試劑盒除去體系中鹽，再乙醇沉淀獲得了較好的效果。因?yàn)樵噭┖型诟啕} 低ph值時(shí)吸附dna，在低鹽高ph值時(shí)洗脫。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 21:50:08
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dorecnu: 金幣+2, ★★★很有幫助, 抽提是為了除去體系中的蛋白。乙醇沉淀對(duì)dna的回收沒(méi)有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我覺(jué)得會(huì)比試劑盒高。試劑盒的問(wèn)題是有回收片段的偏好性，效率因試劑盒廠家不同波動(dòng)較大，另外洗脫體積往往較大；優(yōu)點(diǎn)是除鹽，除蛋白比較徹底，我嘗試使用天根Pcr片段純化試劑盒除去體系中鹽，再乙醇沉淀獲得了較好的效果。因?yàn)樵噭┖型诟啕} 低ph值時(shí)吸附dna，在低鹽高ph值時(shí)洗脫。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 21:50:08
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如果你的樣品能夠雙酶切，說(shuō)明樣品很純了已經(jīng)，為什么還要抽提？ 而且珍貴的樣品乙醇沉淀會(huì)損失很多 建議酶切完畢后直接上PCR產(chǎn)物回收試劑盒，最后用水elution |
3樓2013-01-29 08:47:37
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