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dorecnu木蟲 (正式寫手)
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[求助]
挽救一個被錯誤操作的乙醇沉淀實驗
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背景：雙酶切后準備酚氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮DNA. 樣品比較珍貴不能重新制備樣品。 錯誤：忘記了氯仿抽提步驟，在DNA溶液中加入了乙酸鈉。 問題：1.加入乙酸鈉后是否可重復酚氯仿抽提步驟？ 2.如不能，將錯就錯，繼續(xù)乙醇沉淀。大量的蛋白也會被沉淀下來，會不會影響下一步DNA電泳。（制備的DNA準備用于southernblot 實驗） 自己想的解決辦法： 1.將已加入乙酸的DNA溶液繼續(xù)酚氯仿抽提，后乙醇沉淀。 這個方案的風險在于，高鹽濃度下酚氯仿抽提會不會DNA也隨之被抽走。因為我發(fā)現乙酸鈉是可以溶解于酚氯仿溶液中的。 2.將錯就錯的繼續(xù)乙醇沉淀后，將乙醇、蛋白沉淀重新溶解于水中。重復酚氯仿抽提乙醇沉淀步驟，重新濃縮DNA。 該方案的風險在于反復沉淀可能造成DNA的大量損失。 請問各位木蟲，有沒有遇到相似的問題？能否支點招？ 在線等！ 謝謝大家。 [ Last edited by dorecnu on 2013-1-28 at 16:35 ] |
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 PCR問題集錦 |
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cicelyzh
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感謝參與，應助指數 +1
dorecnu: 金幣+1, ★有幫助, 謝謝回復。我試過了，高鹽濃度下dna回收率會降低60%以上；另外乙酸鈉是可以溶解在酚氯仿中的，置于和水的分配比例不知道。比較好的解決方案是使用PCR片段回收試劑盒除鹽，除蛋白后再用乙醇沉底濃縮一次。 2013-01-29 20:47:48
dorecnu: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-29 21:30:46
kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-01-29 21:49:50
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| 我認為你直接用酚氯仿抽蛋白是沒有問題的。DNA是不溶于有機相的，鹽好像應該在水相里吧，加了鹽DNA也是在水相里，用乙醇或者異丙醇才會沉淀。 |
2樓2013-01-29 01:31:04
bubble1220
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dorecnu: 金幣+2, ★★★很有幫助, 抽提是為了除去體系中的蛋白。乙醇沉淀對dna的回收沒有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我覺得會比試劑盒高。試劑盒的問題是有回收片段的偏好性，效率因試劑盒廠家不同波動較大，另外洗脫體積往往較大；優(yōu)點是除鹽，除蛋白比較徹底，我嘗試使用天根Pcr片段純化試劑盒除去體系中鹽，再乙醇沉淀獲得了較好的效果。因為試劑盒往往在高鹽 低ph值時吸附dna，在低鹽高ph值時洗脫。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-01-29 21:50:08
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dorecnu: 金幣+2, ★★★很有幫助, 抽提是為了除去體系中的蛋白。乙醇沉淀對dna的回收沒有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我覺得會比試劑盒高。試劑盒的問題是有回收片段的偏好性，效率因試劑盒廠家不同波動較大，另外洗脫體積往往較大；優(yōu)點是除鹽，除蛋白比較徹底，我嘗試使用天根Pcr片段純化試劑盒除去體系中鹽，再乙醇沉淀獲得了較好的效果。因為試劑盒往往在高鹽 低ph值時吸附dna，在低鹽高ph值時洗脫。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-01-29 21:50:08
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如果你的樣品能夠雙酶切，說明樣品很純了已經，為什么還要抽提？ 而且珍貴的樣品乙醇沉淀會損失很多 建議酶切完畢后直接上PCR產物回收試劑盒，最后用水elution |
3樓2013-01-29 08:47:37
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