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sxxuan金蟲(chóng) (著名寫手)
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[求助]
超聲破碎后跑膠有拖尾，是蛋白降解還是？
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用的是重組菌，載體是pET28a，宿主菌是BL21,37℃誘導(dǎo)6h后收集菌體，以1/10體積的PBS或超聲buffer重懸菌體，1.5ml的EP管加入1ml懸液，超聲破碎，條件是工作1s停1s，連續(xù)1min后冰浴1min，然后重復(fù)一次，超聲是在冰水浴中進(jìn)行的。12000rpm離心10min后跑核酸電泳，結(jié)果如第一張圖發(fā)現(xiàn)有拖尾，有些條帶看起來(lái)很虛很模糊，第二次就增加了25℃低溫誘導(dǎo)過(guò)夜，只超聲了1次沒(méi)有重復(fù)，還是差不多，這是什么原因？是超聲不夠還是超聲條件有問(wèn)題？可以如何避免或改善？ ps：我的目的蛋白很大，所以用核酸電泳檢測(cè)也沒(méi)問(wèn)題的，如果用SDS-PAGE檢測(cè)的話只能檢測(cè)到單體。 另外就是同樣的培養(yǎng)條件和超聲條件，但結(jié)果好像會(huì)有差異（如第三張圖），原因可能是什么？ 圖片1.jpg 圖片2.jpg 圖片3.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2013-04-27 17:02:47
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我?guī)熃阕鲞@個(gè)超聲波破碎的，我把她拉過(guò)來(lái)問(wèn)了她，她說(shuō)： 1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要純化（目的蛋白上帶個(gè)標(biāo)簽比如GST、HIS，過(guò)柱子純化）后再做PAGE。 2）你的圖1和2是瓊脂糖膠 然后紫外拍照 是吧，好像流程不是這么做的。一般超聲破碎完 蛋白PAGE膠->考馬斯亮藍(lán)染色，看看蛋白 是否表達(dá)，如果表達(dá)：超聲破碎完的蛋白 純化->PAGE膠->考馬斯亮藍(lán)染色，如果蛋白表達(dá)量低不足以 到染色的最小敏感值，那就增加上樣量，無(wú)效的話再轉(zhuǎn)膜做WB（不過(guò)你說(shuō)你的蛋白很大 不影響，這個(gè)我不懂 就不做評(píng)論了） 3）你的目的蛋白 是多聚體嗎？你查一下各個(gè)單體之間的作用力是什么，四級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用需要非共價(jià)鍵，包括：疏水鍵(SDS可破壞)、鹽鍵、范德華力、二硫鍵（被loading buffer中巰基乙醇或DTT破壞）。根據(jù)你的蛋白非共價(jià)鍵 在配置上樣buffer和膠的時(shí)候注意 放什么不放什么，或許就能檢測(cè)到 多聚體了 |
2樓2013-02-01 13:16:25
sxxuan
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謝謝您這么詳細(xì)的回答 1. 我的蛋白是多聚體，有2500kD那么大。我看文獻(xiàn)都是直接跑瓊脂糖膠的，所以也有樣學(xué)樣。由于實(shí)在太大，所以用普通的PAGE也難以檢測(cè)，本來(lái)想跑非變性的，但老大說(shuō)跑核酸電泳就可以，so~ 2. 載體不帶標(biāo)簽，我嘗試用分子篩純化，效果也不是特別好。因?yàn)槲蚁Ｍ褮埩舻馁|(zhì)粒去除干凈，但總會(huì)有殘留，而且出現(xiàn)好幾個(gè)峰。所以希望看看是不是超聲條件有問(wèn)題，把蛋白降解了，或者是表達(dá)的時(shí)候過(guò)度包裝或者包裝不夠 |
3樓2013-02-04 11:47:39
yongbo_liang
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【答案】應(yīng)助回帖
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電泳時(shí)的托尾現(xiàn)象和你樣品有很大關(guān)系 1.樣品太濃了 2.樣品中含有溶解性不好的東西，你可以把加完上樣BUFFER的樣品離心后，再電泳就會(huì)好了。 |
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豆豆52734樓2013-02-04 14:20:41
sxxuan
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5樓2013-02-04 14:27:45
6樓2013-03-29 21:24:13
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