 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3146 | 回復: 5 | |||
sxxuan金蟲 (著名寫手)
|
[求助]
超聲破碎后跑膠有拖尾，是蛋白降解還是？
|
|
用的是重組菌，載體是pET28a，宿主菌是BL21,37℃誘導6h后收集菌體，以1/10體積的PBS或超聲buffer重懸菌體，1.5ml的EP管加入1ml懸液，超聲破碎，條件是工作1s停1s，連續(xù)1min后冰浴1min，然后重復一次，超聲是在冰水浴中進行的。12000rpm離心10min后跑核酸電泳，結果如第一張圖發(fā)現(xiàn)有拖尾，有些條帶看起來很虛很模糊，第二次就增加了25℃低溫誘導過夜，只超聲了1次沒有重復，還是差不多，這是什么原因？是超聲不夠還是超聲條件有問題？可以如何避免或改善？ ps：我的目的蛋白很大，所以用核酸電泳檢測也沒問題的，如果用SDS-PAGE檢測的話只能檢測到單體。 另外就是同樣的培養(yǎng)條件和超聲條件，但結果好像會有差異（如第三張圖），原因可能是什么？ 圖片1.jpg 圖片2.jpg 圖片3.jpg |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有152人回復
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 超聲破碎細胞之后 離心轉速問題
已經(jīng)有15人回復
- 蛋白誘導不能表達！
已經(jīng)有21人回復
- 胞內(nèi)酶不能用超聲破碎怎么辦？
已經(jīng)有15人回復
- 蛋白包涵體透析后雜蛋白很多，請教原因
已經(jīng)有10人回復
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助, 整個流程都說得很清楚，謝謝 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖應助！ 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置頂 2013-04-27 17:02:47
感謝參與，應助指數(shù) +1
sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助, 整個流程都說得很清楚，謝謝 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖應助！ 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置頂 2013-04-27 17:02:47
|
我?guī)熃阕鲞@個超聲波破碎的，我把她拉過來問了她，她說： 1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要純化（目的蛋白上帶個標簽比如GST、HIS，過柱子純化）后再做PAGE。 2）你的圖1和2是瓊脂糖膠 然后紫外拍照 是吧，好像流程不是這么做的。一般超聲破碎完 蛋白PAGE膠->考馬斯亮藍染色，看看蛋白 是否表達，如果表達：超聲破碎完的蛋白 純化->PAGE膠->考馬斯亮藍染色，如果蛋白表達量低不足以 到染色的最小敏感值，那就增加上樣量，無效的話再轉膜做WB（不過你說你的蛋白很大 不影響，這個我不懂 就不做評論了） 3）你的目的蛋白 是多聚體嗎？你查一下各個單體之間的作用力是什么，四級結構相互作用需要非共價鍵，包括：疏水鍵(SDS可破壞)、鹽鍵、范德華力、二硫鍵（被loading buffer中巰基乙醇或DTT破壞）。根據(jù)你的蛋白非共價鍵 在配置上樣buffer和膠的時候注意 放什么不放什么，或許就能檢測到 多聚體了 |
2樓2013-02-01 13:16:25
sxxuan
金蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 4
- 應助: 107 (高中生)
- 金幣: 3442.4
- 散金: 104
- 紅花: 17
- 帖子: 1478
- 在線: 266.1小時
- 蟲號: 512865
- 注冊: 2008-02-27
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物化學
3樓2013-02-04 11:47:39
yongbo_liang
新蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應助: 43 (小學生)
- 金幣: 266.2
- 散金: 10
- 帖子: 114
- 在線: 52.5小時
- 蟲號: 2009557
- 注冊: 2012-09-18
- 專業(yè): 生物大分子結構與功能
豆豆52734樓2013-02-04 14:20:41
sxxuan
金蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 4
- 應助: 107 (高中生)
- 金幣: 3442.4
- 散金: 104
- 紅花: 17
- 帖子: 1478
- 在線: 266.1小時
- 蟲號: 512865
- 注冊: 2008-02-27
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物化學
5樓2013-02-04 14:27:45
6樓2013-03-29 21:24:13
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 sxxuan 的主題更新
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +6 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +10 | ADT 2026-03-11 | 10/500 |
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 +3 | pupcoco 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[教師之家] 焦慮 +8 | 水冰月月野兔 2026-03-13 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑 +6 | 為學666 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工求調(diào)劑 +5 | 緒幸與子 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +4 | 小賈同學123 2026-03-15 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調(diào)劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 26考研一志愿中國石油大學(華東)305分求調(diào)劑 +3 | 嘉年新程 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工 323 英一+數(shù)二+物化，一志愿：哈工大 本人本科雙一流 +4 | 自由的_飛翔 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 255求調(diào)劑 +3 | 李嘉慧， 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 【0703化學調(diào)劑】-一志愿華中師范大學-六級475 +5 | Becho359 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +4 | 學員97LZgn 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | Mochaaaa 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +3 | 小匕仔汁 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 277求調(diào)劑 +4 | anchor17 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +3 | 李政瑩 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|