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nuclearfan銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于雙標(biāo)的免疫熒光很大困惑！��！
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求高手解答：本人用免疫熒光檢測(cè)一個(gè)復(fù)雜細(xì)胞類型的組織切片某蛋白的表達(dá)，用一個(gè)mouse源的抗體標(biāo)記細(xì)胞類型，用另一個(gè)Rabbit源的抗體標(biāo)記這個(gè)蛋白。在此之前我已經(jīng)用DAB的IHC（ABC法）對(duì)單獨(dú)的抗體實(shí)驗(yàn)成功，對(duì)照同樣沒(méi)有問(wèn)題，分別的抗體陽(yáng)性的細(xì)胞類型應(yīng)該是部分重合或根本不重合。免疫熒光的2抗是488標(biāo)的donkey anti-Mouse和594標(biāo)的donkey anti-Rabbit（都是Santa的），封閉使用的羊血清不少于3小時(shí)，一抗1：100稀釋4度過(guò)夜，洗滌5X3，二抗1：200 RT 1小時(shí)。這幾次的結(jié)果是通過(guò)merge后 完全重合。后來(lái)我補(bǔ)充了個(gè)實(shí)驗(yàn)，只用單一的mouse源一抗和抗mouse的2抗做了個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)照（488），分別用綠光 藍(lán)光 黃光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)都能打出相同位置的光，只是顏色不同（普通的電鏡不是共聚焦）。 我很困惑，求高手耐心解答��！在線等！！如有不明確的，可以指出，我重新說(shuō)明 |
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yanjun_guo
鐵蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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mouse源的抗體標(biāo)記細(xì)胞類型：標(biāo)記在細(xì)胞的那個(gè)部位？是細(xì)胞質(zhì)？細(xì)胞膜還是細(xì)胞核？檢測(cè)蛋白的抗體又是表達(dá)在細(xì)胞的那個(gè)部位？在做單獨(dú)的抗體實(shí)驗(yàn)的時(shí)候應(yīng)該能夠確定的。 “這幾次的結(jié)果是通過(guò)merge后 完全重合”只能說(shuō)明，2者表達(dá)部位有重疊。表達(dá)部位相同。 根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，感覺(jué)“分別用綠光 藍(lán)光 黃光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)都能打出相同位置的光，只是顏色不同”的現(xiàn)象好像是顯微鏡的問(wèn)題。我以前也出現(xiàn)過(guò)，后來(lái)找廠家來(lái)調(diào)節(jié)的。 |
2樓2013-02-24 20:29:13
3樓2013-02-24 20:31:03
4樓2017-11-27 21:44:43
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