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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » QPCR擴增效率太低
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[交流]
QPCR擴增效率太低
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大家好，我做QPCR基因擴增效率的時候，一個基因由于CT太大，所以只進行4個2倍的稀釋度，二步法退火溫度是61度擴增效率不高只有78%（圖1）溶解曲線（圖3），所以我做了三步法退火溫度59度擴增效率反而更低了只有57%（圖2）溶解曲線（圖4），很奇怪，請教下大家看這是什么原因，該怎么改進呢？有看到資料說把引物濃度提高，不知道效果怎樣。 圖1.jpg 圖2.jpg 圖3.jpg 圖4.jpg |
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2樓2013-02-27 09:40:24
3樓2013-02-27 12:57:32
★
shiliyusly(金幣+1): 謝謝參與
shiliyusly(金幣+1): 謝謝參與
| 基因豐度不夠，CT數(shù)太大造成的。如果樣品的CT值過高定量也不準確。你可以試試加大模板用量，或者逆轉(zhuǎn)錄時在反應體系中加入目的基因特異性3'引物。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
shiliyusly4樓2013-02-27 13:27:56
5樓2013-02-27 16:12:12
6樓2013-02-27 16:14:04
7樓2013-02-27 16:19:05
★ ★
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-02-28 10:37:45
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-02-28 10:37:45
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遇到這種情況我有兩個做法。一個是PCR時內(nèi)標與豐度低的基因用不同量模板，使它們的CT值在20-30，計算的時候能夠把模板用量差別算進去。豐度實在差別太大的話，反轉(zhuǎn)錄時引入低豐度基因特異引物提高其反轉(zhuǎn)錄效率，但是這樣做引入的差別是無法計算回去的。如果你要做不同樣品的相對表達，第二種做法也是可以的，只是無法衡量基因表達的絕對豐度。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
8樓2013-02-28 06:43:53
9樓2013-02-28 07:45:44
10樓2013-02-28 09:14:27
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剛才我把這個基因做擴增效率的4個濃度中最小濃度去掉了（CT值39），就剩了3個濃度的擴增效率有102%了，溶解曲線圖和擴增效率曲線如下圖： A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg (DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jpg 5HJGZ@W7$A~7[W~W)KHNO5J.jpg 但是我用相同方法把相同濃度梯度，三步法和退火溫度低2度反應的最低濃度去掉后，擴增效率只有73%，不是應該更大嗎？你看我上面得到的102%可信嗎？我平時做的楊梅這個基因CT是36左右。 [ Last edited by shiliyusly on 2013-2-28 at 15:53 ] |
11樓2013-02-28 15:47:52
12樓2013-03-01 00:37:22
13樓2013-03-01 12:22:54
14樓2013-03-02 04:37:29
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20樓2015-04-24 09:49:02
21樓2015-04-24 10:31:17
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