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Jane19900526金蟲 (初入文壇)
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[求助]
赤霉菌原生質(zhì)體制備，制不出來，求大神幫助~~~急~~~
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我最近一直在做赤霉菌原生質(zhì)體制備，參考的是張文宣 趙南 朱江萍的赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備、純化與再生工藝的研究，按照他的方法，配制2%纖維素酶，1%蝸牛酶和0.1%溶菌酶，用的溶液是高滲溶液（0.7M NaCl），酶液用0.2μm水系濾膜過濾待用。 做過（1）赤霉菌平板上的菌絲直接加到酶液中放在30℃恒溫箱中酶解（適當振蕩），每隔0.5h用油鏡觀察。 （2）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，用4層擦鏡紙過濾得孢子懸液，7000rpm離心10min之后，用高滲溶液洗滌2次之后，用高滲溶液重懸，取一定量到酶液中放在30℃恒溫箱中酶解（適當振蕩），由于放在載玻片上不能使液體干了之后觀察，加入香柏油之后油鏡觀察看到圓形物質(zhì)，學長說是氣泡，所以直接用相差顯微鏡觀察，每隔0.5h觀察，觀察了5h都沒有發(fā)現(xiàn)圓形或球形。。。 （3）所以我以為是酶液的濃度不夠，還有孢子的細胞壁比菌絲的細胞壁厚，我配制了4%纖維素酶，2%蝸牛酶，重復上述步驟，還是觀察不到原生質(zhì)體。。。 （上述都在無菌環(huán)境下進行） 不知道是什么原因，請大神指點迷津，萬分感激�。�！ |
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zhqw423
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7樓2013-03-05 16:26:41
Jane19900526
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2樓2013-03-04 12:04:43
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我看過這方面的資料，但自己還沒開始做，不過看了你的操作，可以給你一點建議： 1. 菌絲采用對數(shù)期菌絲，培養(yǎng)24h可能有點短，你要保證開始有足夠的菌絲量（用新鮮菌絲比活化的孢子好些，可以多培養(yǎng)幾瓶，鏡檢菌絲形態(tài)確定）； 2. 4層擦鏡紙過濾，可能太厚了，因為真菌無論菌絲還是孢子都比較粗大，我們平常過濾放線菌也就用2層擦鏡紙，你用4層，可能收集到的菌絲量會很少（可以對濾液進行鏡檢確定一下），過濾前，可以加入玻璃珠對菌絲振蕩一下，將菌絲打成片段，這樣肯那個會好些； 3. 赤霉菌本身在40倍下即可觀察，其原生質(zhì)體直徑應(yīng)該比菌絲直徑大些，所以你用相差顯微鏡在40倍下應(yīng)該就可以清楚觀察到，不必使用油鏡（避免油中水泡干擾）。 4.實在不確定，你就放到高滲再生平板上，看能否再生。 一些建議，希望對你有幫助。 |
3樓2013-03-05 09:59:47
zhqw423
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4樓2013-03-05 10:02:31
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