 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (5965)
- >導(dǎo)師招生 (1220)
- >考研 (1065)
- >文獻(xiàn)求助 (489)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (295)
- >考博 (204)
- >休閑灌水 (182)
- >基金申請(qǐng) (180)
- >碩博家園 (136)
- >招聘信息布告欄 (104)
- >博后之家 (90)
- >綠色求助(高懸賞) (51)
- >論文投稿 (45)
- >找工作 (40)
- >SciFinder/Reaxys (24)
- >外文書(shū)籍求助 (19)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2480 | 回復(fù): 9 | |||
樹(shù)蛙wagaa新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[交流]
ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法介紹 已有8人參與
|
|
隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使體外檢測(cè)各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子(CK)或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于： 1、ELISA通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較得出可溶性蛋白總量。 2、 ELISPOT通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率) 3、由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從 20萬(wàn)-30萬(wàn) 細(xì)胞中檢出 1個(gè) 分泌該蛋白的細(xì)胞。 4、捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。 ELISPOT檢測(cè)原理：細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)"紫色"的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò)ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。 ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)、疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過(guò)敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩選等等。 現(xiàn)介紹檢測(cè)人現(xiàn)介紹檢測(cè)人IFNγ為例的PVDF Eli-spot法，僅供參考。 試劑盒內(nèi)容：PVDF96孔板，室溫保存;0.1ml捕獲抗體，4℃保存;0.1ml生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，4℃保存;15ul親和素堿性磷酸酶標(biāo)，4℃保存;0.25g牛血清白蛋白，4℃保存;0.25g脫脂乳，4℃保存;11ml底物緩沖液，4℃保存;11ml濃縮PBS(10X)，室溫保存;11ml濃縮洗滌液(200x)，室溫保存。 自備材料/試劑： 細(xì)胞培養(yǎng)液，CO2孵育箱，70%酒精。 直接的和間接的Eli-spot法 可在已包被抗體的孔中直接刺激細(xì)胞(直接法)，或在24孔板或燒瓶中先刺激細(xì)胞，然后放入已包被的孔中(間接法)。使用哪種方法基于：1)檢測(cè)細(xì)胞的類(lèi)型;2)希望得到的細(xì)胞量。如果只需少量的細(xì)胞因子生成細(xì)胞，使用直接法;如果細(xì)胞因子生成細(xì)胞較多，最好使用間接法。其它步驟一致。 刺激方法：建議用PMA和婁諾霉素刺激PBMC，使其產(chǎn)生IFNγ。在培養(yǎng)液中稀釋PBMC(如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清)，其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾霉素(Sigma, Saint Louis, MO)。加2.104至5.104個(gè)細(xì)胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時(shí)。其它的刺激劑孵育時(shí)間可能不同，基于細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量，按不同情況作最佳選擇。 試劑的準(zhǔn)備：1. 10ml磷酸緩沖鹽(PBS，10X)以90ml蒸餾水稀釋;2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，最終濃度為2%;3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀釋的PBS，最終濃度為1%;4. 10ml濃縮洗滌液(200x)以1990ml蒸餾水稀釋;5. 10ul親和素堿性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋?zhuān)罱K濃度為70%。 Eli-spot操作過(guò)程： 1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。 2. 倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。 3. 3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過(guò)夜。 4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。 5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見(jiàn)試劑準(zhǔn)備)，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí)。 6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。 7.用100ul PBS洗滌一次。 8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液(含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑)。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時(shí)間(15-20小時(shí))。這期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。 9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。 10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。 11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。 12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測(cè)抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時(shí)30分。 13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。 14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時(shí)。 15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。 16.每孔加入100ul BCIP/NBT。 17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤(pán)中。 18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時(shí)，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一夜，點(diǎn)會(huì)比較明顯。 此板在室溫下避光保存。使用時(shí)應(yīng)注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的致癌物質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)帶手套，使用后適當(dāng)處理。對(duì)MAIPAN4510板，孵育時(shí)由于毛細(xì)作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導(dǎo)致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時(shí)將板底移去，將膜倒轉(zhuǎn)，用蒸餾水流沖洗，同時(shí)用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由于板底已移去，建議將MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步驟不變。 本文由探生科技技術(shù)人員提供，如果您想了解更多關(guān)于生物儀器器械或抗體的信息，可以訪(fǎng)問(wèn)Fantibody全球抗體搜索引擎,您身邊的抗體專(zhuān)家!致力于為研究人員提供全球商品化抗體查詢(xún)、采購(gòu)、抗體定制、應(yīng)用技術(shù)支持服務(wù),希望對(duì)您有幫助！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
一志愿陜師大生物學(xué)071000，298分，求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
306求0703調(diào)劑一志愿華中師范
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
333求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
335求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
336求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
303求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085600材料與化工調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
291求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
0703化學(xué)求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
07化學(xué)280分求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 細(xì)胞因子的檢測(cè)方法
已經(jīng)有0人回復(fù)
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
2樓2013-03-04 19:22:12
心儀ktm 
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 203
- 散金: 557
- 帖子: 60
- 在線(xiàn): 71小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2639318
- 注冊(cè): 2013-09-06
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 腫瘤生物治療
3樓2013-11-03 10:02:06
大甫哥
銀蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 86.8
- 帖子: 150
- 在線(xiàn): 31.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 3133639
- 注冊(cè): 2014-04-13
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 免疫學(xué)研究新技術(shù)與新方法
4樓2014-05-07 20:49:28
| 好 |
5樓2014-10-22 16:19:04
6樓2014-10-23 08:53:01
jasonwyb123
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 59 (初中生)
- 金幣: 1229.6
- 紅花: 1
- 帖子: 205
- 在線(xiàn): 29.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1751129
- 注冊(cè): 2012-04-12
- 專(zhuān)業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
7樓2015-05-06 11:20:02
beaver_tonny
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 10
- 帖子: 1
- 在線(xiàn): 13分鐘
- 蟲(chóng)號(hào): 2266993
- 注冊(cè): 2013-01-30
- 專(zhuān)業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
8樓2016-03-23 23:30:10
18294345770
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 29.8
- 帖子: 7
- 在線(xiàn): 2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 6662469
- 注冊(cè): 2017-06-01
- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
9樓2017-06-15 20:44:22
18294345770
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 29.8
- 帖子: 7
- 在線(xiàn): 2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 6662469
- 注冊(cè): 2017-06-01
- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
|
我們上課做實(shí)驗(yàn)用的是酶標(biāo)分光光度計(jì)法，麻煩問(wèn)一下這個(gè)數(shù)據(jù)分析求出來(lái)的平均數(shù)有什么意義呢 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
10樓2017-06-15 20:48:18
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 樹(shù)蛙wagaa 的主題更新
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 335求調(diào)劑 +3 | yuyu宇 2026-03-23 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +5 | hhhhxn.. 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
[考研] 328求調(diào)劑，英語(yǔ)六級(jí)551，有科研經(jīng)歷 +7 | 生物工程調(diào)劑 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[論文投稿] 急發(fā)核心期刊論文 +3 | 賢達(dá)問(wèn)津 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 298-一志愿中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-求調(diào)劑 +10 | 手機(jī)用戶(hù) 2026-03-17 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 350求調(diào)劑 +6 | weudhdk 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +4 | LHHL66 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 招08考數(shù)學(xué) +6 | laoshidan 2026-03-20 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +10 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)070300 學(xué)碩336求調(diào)劑 +5 | vv迷 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 安憶靈 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | @taotao 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 余意卿 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +3 | 晨昏線(xiàn)與星海 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +10 | S.H1 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)，327分，材料與化工085600 +9 | Ncdx123456 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研]
 295復(fù)試調(diào)劑
+8
|
簡(jiǎn)木ChuFront 2026-03-19 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國(guó)海洋大學(xué)，生物學(xué)，301分，求調(diào)劑 +5 | 1孫悟空 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿南京大學(xué)，080500材料科學(xué)與工程，調(diào)劑 +4 | Jy? 2026-03-16 | 4/200 |
|