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樹蛙wagaa新蟲 (初入文壇)
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ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點法介紹 已有8人參與
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隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學及生物學領(lǐng)域的廣泛應用，使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細胞因子(CK)或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。 ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于： 1、ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。 2、 ELISPOT通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率) 3、由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從 20萬-30萬 細胞中檢出 1個 分泌該蛋白的細胞。 4、捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。 ELISPOT檢測原理：細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)"紫色"的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。 ELISPOT技術(shù)應用領(lǐng)域：移植中排斥反應的預測、疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學反應的篩選等等。 現(xiàn)介紹檢測人現(xiàn)介紹檢測人IFNγ為例的PVDF Eli-spot法，僅供參考。 試劑盒內(nèi)容：PVDF96孔板，室溫保存;0.1ml捕獲抗體，4℃保存;0.1ml生物素標記檢測抗體，4℃保存;15ul親和素堿性磷酸酶標，4℃保存;0.25g牛血清白蛋白，4℃保存;0.25g脫脂乳，4℃保存;11ml底物緩沖液，4℃保存;11ml濃縮PBS(10X)，室溫保存;11ml濃縮洗滌液(200x)，室溫保存。 自備材料/試劑： 細胞培養(yǎng)液，CO2孵育箱，70%酒精。 直接的和間接的Eli-spot法 可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞(直接法)，或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中(間接法)。使用哪種方法基于：1)檢測細胞的類型;2)希望得到的細胞量。如果只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法;如果細胞因子生成細胞較多，最好使用間接法。其它步驟一致。 刺激方法：建議用PMA和婁諾霉素刺激PBMC，使其產(chǎn)生IFNγ。在培養(yǎng)液中稀釋PBMC(如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清)，其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾霉素(Sigma, Saint Louis, MO)。加2.104至5.104個細胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時。其它的刺激劑孵育時間可能不同，基于細胞因子生成細胞的量，按不同情況作最佳選擇。 試劑的準備：1. 10ml磷酸緩沖鹽(PBS，10X)以90ml蒸餾水稀釋;2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，最終濃度為2%;3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀釋的PBS，最終濃度為1%;4. 10ml濃縮洗滌液(200x)以1990ml蒸餾水稀釋;5. 10ul親和素堿性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋，最終濃度為70%。 Eli-spot操作過程： 1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。 2. 倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。 3. 3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過夜。 4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。 5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準備)，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。 6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。 7.用100ul PBS洗滌一次。 8.每孔加入100ul細胞懸浮液(含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑)。細胞可預先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標準的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間(15-20小時)。這期間不要晃動或移動孔板。 9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。 10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。 11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。 12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。 13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。 14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。 15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。 16.每孔加入100ul BCIP/NBT。 17.室溫下反應5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應的盤中。 18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。 此板在室溫下避光保存。使用時應注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的致癌物質(zhì)，試驗時帶手套，使用后適當處理。對MAIPAN4510板，孵育時由于毛細作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時將板底移去，將膜倒轉(zhuǎn)，用蒸餾水流沖洗，同時用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由于板底已移去，建議將MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步驟不變。 本文由探生科技技術(shù)人員提供，如果您想了解更多關(guān)于生物儀器器械或抗體的信息，可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎,您身邊的抗體專家!致力于為研究人員提供全球商品化抗體查詢、采購、抗體定制、應用技術(shù)支持服務,希望對您有幫助！ |
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