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[求助] 毛狀根DNA的提取

求助�。。。。。。。�！

現(xiàn)在在做東南景天的毛狀根誘導(dǎo)，按照CTAB法的試劑盒提取，死活提取不出來毛狀根的DNA�。。。�！

文獻(xiàn)上報(bào)道說SDS和CTAB法都可以提出出來，為毛我的就提取不出來呢？？？

蟲友們幫我啊。。。。哭。。。。。

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1樓 2013-03-20 11:16:51

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Bella0224: 金幣+2, ★有幫助 2013-03-21 21:26:15

CTAB法可以提取發(fā)根DNA，樓主需要詳細(xì)說明你的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)步驟，單憑這么幾句話，誰也幫不了你

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2樓2013-03-20 19:24:46

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泠安然

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Bella0224: 金幣+3, ★有幫助 2013-03-21 21:25:18

我們提取毛狀根的時(shí)候就是用的CTAB，研磨時(shí)候用的石英砂和PVP，其中還用到了苯酚，氯仿等溶劑進(jìn)行純化，你應(yīng)該把步驟貼出來，這樣才能知道你是哪個(gè)步驟出的問題

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3樓2013-03-21 16:54:03

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3樓: Originally posted by 泠安然 at 2013-03-21 16:54:03
我們提取毛狀根的時(shí)候就是用的CTAB，研磨時(shí)候用的石英砂和PVP，其中還用到了苯酚，氯仿等溶劑進(jìn)行純化，你應(yīng)該把步驟貼出來，這樣才能知道你是哪個(gè)步驟出的問題

是這樣的：

1.取毛狀根0.5g（因?yàn)槲业拿珷罡L(zhǎng)的不好，所以原料很少，各位有什么好辦法令毛狀根長(zhǎng)勢(shì)好一些么？），液氮研磨至粉末。
2.轉(zhuǎn)移細(xì)粉到一個(gè)1.5ml離心管，不解凍，加600μl 65℃預(yù)熱的裂解液PL (加入β-巰基乙醇至2%)，劇烈渦旋振蕩混勻，用大口徑槍頭輕柔吹打幫助裂解，加入6μl RNA酶（20mg/ml）。
3.65℃水浴30分鐘，在水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。
4.用等體積酚/氯仿（1：1）抽提一遍。
5.加入700μl氯仿/異戊醇（體積比24：1混合），顛倒充分混勻幾分鐘，13,000rpm 離心5分鐘。
6.小心吸取上清到新的1.5ml離心管。如上清比較渾濁，則需要重復(fù)步驟4一遍，直到得到透亮上清。
7.加入1.5倍體積結(jié)合液PQ （已加入無水乙醇）后立刻渦旋，充分混勻。
8.將上一步所得混合物（包括可能出現(xiàn)的沉淀）加入吸附柱AC中，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
8. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
9. 加入700μl漂洗液WB（已加入無水乙醇），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
10. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
11. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，除去漂洗液。
12. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65℃水浴中預(yù)熱），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

就這樣，用的試劑公司的試劑盒，買過兩次，康為的和艾德萊公司，植物CTAB法提取試劑盒，提過N次還是提不出來。。。

要哭了。。。

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4樓2013-03-21 21:34:54

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2樓: Originally posted by starseacow at 2013-03-20 19:24:46
CTAB法可以提取發(fā)根DNA，樓主需要詳細(xì)說明你的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)步驟，單憑這么幾句話，誰也幫不了你

我在樓下回復(fù)了，有詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟，麻煩各位蟲友了。。。。

PS：我的毛狀根材料很少，提取時(shí)取的量比較少，跑電泳圖在紫外下照只有Marker，DNA一點(diǎn)都沒有

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5樓2013-03-21 21:36:41

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Bella0224: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-03-22 15:19:07

1 關(guān)于發(fā)根怎樣加快生長(zhǎng)，可以對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，入手方向包括培養(yǎng)基，溫度，光照，轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)瓶裝液量等等
2 樓主貼的方法應(yīng)該是直接參照試劑盒的吧，我做試劑都是自己配的，一般不用試劑盒（有時(shí)候試劑盒吹得很厲害，但很可能只是對(duì)特定某些植物材料效果比較好，使用試劑盒不太好自己調(diào)整摸索）。你的問題一方面我感覺可能是植物材料裂解不完全，試試延長(zhǎng)65度處理時(shí)間，酚氯仿抽提步驟也不要重復(fù)太多次。此外，接下來先不用吸附柱，可以換成傳統(tǒng)CTAB法的處理步驟試試，看能否獲得DNA。

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從你的表述中，可以看出毛狀根DNA量特別少，建議擴(kuò)增內(nèi)源基因，單純電泳跑DNA由于量少，沒有結(jié)果很正常！

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7樓2013-03-22 10:35:44

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引用回帖:

7樓: Originally posted by 紫眸玉兒 at 2013-03-22 10:35:44
從你的表述中，可以看出毛狀根DNA量特別少，建議擴(kuò)增內(nèi)源基因，單純電泳跑DNA由于量少，沒有結(jié)果很正常！

我是否需設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR就可以了？擴(kuò)增毛狀根DNA，只需指的植物基因組DNA的開頭和結(jié)尾，然后加上引物PCR對(duì)么？

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8樓2013-03-22 15:18:52

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6樓: Originally posted by starseacow at 2013-03-22 05:39:58
1 關(guān)于發(fā)根怎樣加快生長(zhǎng)，可以對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，入手方向包括培養(yǎng)基，溫度，光照，轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)瓶裝液量等等
2 樓主貼的方法應(yīng)該是直接參照試劑盒的吧，我做試劑都是自己配的，一般不用試劑盒（有時(shí)候試劑盒吹得很 ...

不用吸附柱的CTAB法。。。好的，我去試一試~

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9樓2013-03-22 15:19:32

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