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jinqimaggie鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
P32 5'標(biāo)記一定要dephosphorylation嗎，不用會(huì)怎樣..謝謝!!
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我用P32 5'端標(biāo)記miRNA protocol里說(shuō)要dephosphorylation（加phosphatase），然后再加gamma P32 標(biāo)記。 但是我標(biāo)記后在imager里看不到樣品的band怎么辦？ 相應(yīng)的RNAmarker也是用5‘端標(biāo)記，沒(méi)有經(jīng)過(guò)dephosphorylation，可以用磷的imager看到黑帶。 求助。非常感激。 |
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cicelyzh
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2樓2013-03-24 11:47:55
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3樓2013-03-25 22:46:09
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4樓2013-03-26 01:38:54
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是，損失很大， 具體過(guò)程是這樣的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)純化，純化后濃度在200ng/微升，感覺(jué)應(yīng)該夠用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿試劑純化，再后用純化后的miRNA與gamma P32, kinase等label, 然后用spin coulumn純化。 這一步純化后因?yàn)闃抢餂](méi)有scintilation counter，所以我直接跑膠（polyacrylamide 15%）。 除去5‘end label，我還做了未經(jīng)dephosphorylation步驟的gamma p32label以及在transcription過(guò)程中用alpha p32 標(biāo)記。 今天在screen上expose了近7個(gè)小時(shí)，仍然看不到band... 快急死了。。。 謝謝。。 |
5樓2013-03-26 07:34:38
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6樓2013-03-26 12:18:43
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還好，是在一周左右做的， 后來(lái)老師發(fā)現(xiàn)RNA的模板濃度太低（16ng/微升），不知道這個(gè)會(huì)不會(huì)影響后面的反應(yīng)。 我做了十管50微升的反應(yīng)，30個(gè)cycle,溫度分別是98,98,58,72，4 攝氏度。然后我把十管收集起來(lái)一起純化，（cycle pure kit）,純化后濃度只有23ng/微升。 但是聽(tīng)老師說(shuō)要想做后面的轉(zhuǎn)錄，模板濃度要至少在微克數(shù)量級(jí)， 我該怎么提高模板濃度， miRNA的分子量在72bp，它的模板應(yīng)該也不大，謝謝^ ^ |
7樓2013-04-03 23:45:07
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8樓2013-04-04 02:34:48
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