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浪漫的馬新蟲 (初入文壇)
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[求助]
WB做不出來
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| 小蟲做WB已經(jīng)快半年了，但是一直沒做出來，蛋白是從MCF-7和HepG-2提取的，我接的一抗是胰島素受體，出來的條帶始終是模模糊糊的，請高手指點(diǎn)。 |
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首先還是從技術(shù)上去找問題，可以直接把提取的蛋白跑個膠，用考馬斯亮藍(lán)染下看看條帶如何。 也有可能目的蛋白比較容易降解，所以最好加一定量的蛋白酶抑制劑。 acting其實(shí)是actin，一種常見內(nèi)參，內(nèi)參表達(dá)量而且穩(wěn)定，所以會比較好檢測。內(nèi)參必須是比較明顯清晰。 我們用的都是比較好的抗體，santa cruze或者millipore、abCam等 另外對于你研究的蛋白不懂，會不會有其他亞型，或者修飾，造成條帶模糊，可以查詢相關(guān)文獻(xiàn)，祝好運(yùn) |
10樓2013-03-28 01:40:00
2樓2013-03-25 16:51:29
浪漫的馬
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3樓2013-03-25 18:05:39
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4樓2013-03-26 17:02:51
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5樓2013-03-27 10:16:25
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7樓2013-03-27 18:32:27
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是條帶不清晰還是條帶非常淺？背景高？ 如果是條帶很明亮但是不清晰，那就是你操作的問題。你可能需要提高WB的操作技術(shù) 特別是電泳和轉(zhuǎn)膜 膠要做好 上樣的時候也要注意 量要適中 還有轉(zhuǎn)膜的時候 注意一下轉(zhuǎn)膜的條件 有的時候是 你的內(nèi)參蛋白很容易轉(zhuǎn)上 但是你的目的蛋白就轉(zhuǎn)不完全 那樣就會導(dǎo)致條帶很淺 背景深 而如果你的轉(zhuǎn)膜三明治沒有做好 有可能會轉(zhuǎn)得花掉 條帶扭曲 甚至上不了膜 如果是 你的條帶形狀啊之類的 都不錯 但是就特別淺 那有很多種原因的 一方面 會不會你的基因本身量很少 那樣當(dāng)然條帶暗 另一方面 你是怎么去裂解細(xì)胞的 是不是裂解液加太多了 你是消化之后收集細(xì)胞到離心管中 再加裂解液的 還是 直接往培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中加裂解液覆蓋整個底部的？ 如果是后者 蛋白濃度會 大大降低 內(nèi)參可以出來 但 目的基因未必能出來 還有就是 你一抗會不會結(jié)合的不好 二抗又是否正常 你要先排查一下其他的原因 再來 懷疑到一抗 否則 會很浪費(fèi)錢 |
9樓2013-03-28 00:30:15
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