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[求助]
求解救，被蛋白質(zhì)困擾。。
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我做的蛋白質(zhì)是假單胞菌分泌的胞外酶，提取方法直接離心降解培養(yǎng)基手機(jī)上清液，棄掉菌體沉淀。降解培養(yǎng)基的主要成分是葡萄糖，牛肉膏（微量），硝酸銨，磷酸鹽緩沖液~現(xiàn)在正在做SDS-PAGE，已經(jīng)做了接近一個(gè)月，還是有各種問題，已經(jīng)沒有信心做出來了，求指教，求解救~問題主要有以下幾點(diǎn)： 1.胞外蛋白含量特別少，一般只有20ug/mL左右，有時(shí)候還檢測(cè)不出來，所以蛋白質(zhì)的條帶特別不清楚。不知道有沒有比較有效的濃縮方法？ 現(xiàn)在使用過超濾管，但是選擇孔徑大小上，我選擇了最小的，3KD，離心一個(gè)小時(shí)濃縮效果不明顯。不知道超濾管的會(huì)不會(huì)損失蛋白 還嘗試過TCA沉淀方法，但是跑電泳之前加入loading煮沸5min之后沉淀不溶解，離心手機(jī)上清液上樣，條帶不好看，而且也不清楚，不知道用到的藥品，三氯乙酸，脫氧膽酸鈉，DTT，丙酮會(huì)不會(huì)影響電泳效果 2 接下來還要做二維電泳，做二維電泳的老師說，上清液中含糖對(duì)電泳影響特別大，建議我除糖，而且要過柱子，不知道要選擇什么填料的柱子，是用什么緩沖液洗脫，需要多大的培養(yǎng)液，這種方法可行性高嗎？這方面一點(diǎn)也不了解，還求大神指教。不知道過柱子之后蛋白純度會(huì)不會(huì)提高？ 現(xiàn)在都快愁白頭了，我們組之前沒有師兄師姐做過，所以特別苦悶。。 |
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我使用TCA沉淀后有明顯的白色沉淀，煮沸之后也不會(huì)溶解，能把你TCA沉淀的方法發(fā)一下嗎？是不是我的方法有問題~
4樓2013-04-01 15:02:52
gaojuan1985
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1. 濃縮，可選用超濾或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE濃縮比較經(jīng)典的方法了。20 ug/ml的話可以取1-2 ml進(jìn)行TCA沉淀，然后上樣。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？說明太多了。我通常用的量都是肉眼使勁看才能看到一點(diǎn)點(diǎn)沉淀的。TCA不會(huì)影響SDS-PAGE，但是對(duì)二維電泳就不清楚啦。 2. 除糖？這倒是很有挑戰(zhàn)性。小的糖肯定能通過透析或者超濾除去。但是很大的糖想除掉還真不容易。LZ可以測(cè)一下糖含量嘛，再做決定 |
2樓2013-04-01 12:50:33
3樓2013-04-01 15:00:10
gaojuan1985
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5樓2013-04-01 15:12:20
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