 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1236 | 回復(fù): 4 | ||
gissingtan新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
有關(guān)于PCR~有能力的師兄師姐幫幫忙~
|
|
最近在做巢式PCR，遇見了各種問題，請(qǐng)大家?guī)兔獯饉 第一張圖是第一次PCR,圖中明亮的條帶切膠，放-20，過夜，第二天早上離心取上清，作為模板進(jìn)行第二次PCR 問題： 1、第二張圖片中marker為什么條帶邊會(huì)彎起？ 2、第二張圖中點(diǎn)樣孔中的亮帶是什么，點(diǎn)樣孔邊的亮帶是什么？ 3、一般marker點(diǎn)多少跑出的條帶好看？ 4、一般的小點(diǎn)樣孔點(diǎn)多少樣跑出的條帶好看？ 謝謝~  第一次PCR.jpg 第二次PCR.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有264人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 哪位師兄師姐有清華大學(xué)的高等量子力學(xué)筆記或歷年考博真題啊，幫幫忙�。。�
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 走過路過的師兄師姐師弟師妹們幫幫忙啊
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 功能基因擴(kuò)增相關(guān)
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 二本院校應(yīng)用化學(xué)考研 怎么選擇學(xué)校？各位師兄師姐幫幫忙~
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 臨近2012考研報(bào)名了， 生物技術(shù)，想考福州大學(xué)，師兄師姐幫幫忙。
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助】沈藥藥學(xué)院的師兄師姐幫幫忙
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 【求助】藥理學(xué)考研已過的師兄師姐們幫幫忙忙吧
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【經(jīng)驗(yàn)】水木上的出國申請(qǐng)總結(jié)-- PS篇
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 2010屆-要上研究生了，需要注意什么問題呢？
已經(jīng)有12人回復(fù)
zxs803
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2054.5
- 紅花: 1
- 帖子: 74
- 在線: 55.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 87654
- 注冊: 2005-08-20
- 性別: GG
- 專業(yè): 系統(tǒng)生物學(xué)
2樓2013-04-10 23:33:36
cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲號(hào): 1614001
- 注冊: 2012-02-13
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2013-04-11 02:21:12
myprayer
專家顧問 (著名寫手)
- MolEPI: 12
- 應(yīng)助: 81 (初中生)
- 貴賓: 2.822
- 金幣: 32408.7
- 散金: 1696
- 紅花: 159
- 沙發(fā): 3
- 帖子: 2275
- 在線: 822.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1759711
- 注冊: 2012-04-16
- 專業(yè): 生物力學(xué)與生物流變學(xué)
- 管轄: 生物醫(yī)藥區(qū)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
1)nested-PCR,主要解決的問題有兩個(gè)方面：一是利用4條引物（2個(gè)內(nèi)引物，2個(gè)外引物）增加了PCR的特異性，二是第2次擴(kuò)增以第一次PCR產(chǎn)物為模板，相對(duì)于基因組模板而言，更加簡單化，有利于引物和模板的有效復(fù)性，提高擴(kuò)增效率。 2）如果要提高擴(kuò)增效果，具備回收的條件的話，回收后繼續(xù)第二次PCR是沒有問題的。如果不具備回收條件，不回收直接稀釋后進(jìn)行二次PCR也可，因?yàn)閮?nèi)引物同樣具有相當(dāng)?shù)奶禺愋�，如果設(shè)計(jì)合理，第一次非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，不能和第二對(duì)引物有效結(jié)合，這樣的非特異產(chǎn)物的模板不能在第二次擴(kuò)增中產(chǎn)生目的條帶。這也正是NESTED PCR的優(yōu)點(diǎn)。 3）其他需要強(qiáng)調(diào)的，我根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，主要是控制好引物的比例，也就是說，如果第一次PCR的引物如果過量的話，剩余引物二次PCR的時(shí)候同樣能有一定的產(chǎn)量，這相對(duì)于第二次PCR而言就是非特異性的產(chǎn)物。解決的方法很簡單，第一次PCR時(shí)，引物盡量摸索最低的加入量，增加循環(huán)次數(shù)，盡量消耗體系中殘余的引物。二次PCR時(shí)，增加內(nèi)引物的量，二者還是有一定競爭關(guān)系，道理不言而喻了。 巢式PCR的定義：巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。 巢式PCR反應(yīng)：巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA片斷。第二對(duì)引物的功能是特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。 第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。從而提高反應(yīng)的特異性 巢式PCR的實(shí)驗(yàn)步驟：第一步：目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對(duì)引物結(jié)合。第一對(duì)引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。 第二步：使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。 巢式PCR的應(yīng)用一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等 在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特異性 在Illumina公司平臺(tái)的第二代高通量測序中，也應(yīng)用類似巢式PCR的原理，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。 首先在目的片段通過TA克隆，引入一個(gè)片段，然后在特定的一個(gè)Flow Cell固定大量的特異探針，通過PCR反應(yīng)的特異性，擴(kuò)增目的片段，然后繼續(xù)應(yīng)用于下一步測序 巢式PCR，可以在10的六次方基因組背景下檢測到一個(gè)拷貝的病毒基因，也不像二次PCR容易產(chǎn)生成片的產(chǎn)物，是效果最好的PCR，擴(kuò)增質(zhì)量最高的PCR。 |
4樓2013-04-11 08:18:26
wangqi1107
銀蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 194.3
- 紅花: 2
- 帖子: 122
- 在線: 121.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 995882
- 注冊: 2010-04-13
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2013-04-11 09:50:54
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 gissingtan 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學(xué)071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿福大288有機(jī)化學(xué)，求調(diào)劑 +3 | 小木蟲200408204 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 346求調(diào)劑[0856] +3 | WayneLim327 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑，求各位老師收留 +10 | 秋有木北 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +4 | 冬十三 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +3 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +5 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +8 | 陌宸希 2026-03-16 | 9/450 |
|
|
|
[考博] 環(huán)境領(lǐng)域全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室招收博士1-2名 +3 | QGZDSYS 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程調(diào)劑 +8 | 大可digkids 2026-03-16 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +3 | 梁梁校校 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +9 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +5 | 大口吃飯 身體健 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085601求調(diào)劑 +4 | Du.11 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 26考研求調(diào)劑 +6 | 丶宏Sir 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | 劉夢微 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 26調(diào)劑/材料科學(xué)與工程/總分295/求收留 +9 | 2026調(diào)劑俠 2026-03-12 | 9/450 |
|