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有關(guān)于PCR~有能力的師兄師姐幫幫忙~
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最近在做巢式PCR，遇見了各種問題，請大家?guī)兔獯饉 第一張圖是第一次PCR,圖中明亮的條帶切膠，放-20，過夜，第二天早上離心取上清，作為模板進行第二次PCR 問題： 1、第二張圖片中marker為什么條帶邊會彎起？ 2、第二張圖中點樣孔中的亮帶是什么，點樣孔邊的亮帶是什么？ 3、一般marker點多少跑出的條帶好看？ 4、一般的小點樣孔點多少樣跑出的條帶好看？ 謝謝~  第一次PCR.jpg 第二次PCR.jpg |
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cicelyzh
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3樓2013-04-11 02:21:12
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【答案】應助回帖
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1)nested-PCR,主要解決的問題有兩個方面：一是利用4條引物（2個內(nèi)引物，2個外引物）增加了PCR的特異性，二是第2次擴增以第一次PCR產(chǎn)物為模板，相對于基因組模板而言，更加簡單化，有利于引物和模板的有效復性，提高擴增效率。 2）如果要提高擴增效果，具備回收的條件的話，回收后繼續(xù)第二次PCR是沒有問題的。如果不具備回收條件，不回收直接稀釋后進行二次PCR也可，因為內(nèi)引物同樣具有相當?shù)奶禺愋�，如果設(shè)計合理，第一次非特異性的擴增產(chǎn)物為模板，不能和第二對引物有效結(jié)合，這樣的非特異產(chǎn)物的模板不能在第二次擴增中產(chǎn)生目的條帶。這也正是NESTED PCR的優(yōu)點。 3）其他需要強調(diào)的，我根據(jù)我的經(jīng)驗，主要是控制好引物的比例，也就是說，如果第一次PCR的引物如果過量的話，剩余引物二次PCR的時候同樣能有一定的產(chǎn)量，這相對于第二次PCR而言就是非特異性的產(chǎn)物。解決的方法很簡單，第一次PCR時，引物盡量摸索最低的加入量，增加循環(huán)次數(shù)，盡量消耗體系中殘余的引物。二次PCR時，增加內(nèi)引物的量，二者還是有一定競爭關(guān)系，道理不言而喻了。 巢式PCR的定義：巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。 巢式PCR反應：巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。 第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增。從而提高反應的特異性 巢式PCR的實驗步驟：第一步：目標的DNA模板藍色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。 第二步：使用圖中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。 巢式PCR的應用一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等 在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特異性 在Illumina公司平臺的第二代高通量測序中，也應用類似巢式PCR的原理，進行目的片段的擴增。 首先在目的片段通過TA克隆，引入一個片段，然后在特定的一個Flow Cell固定大量的特異探針，通過PCR反應的特異性，擴增目的片段，然后繼續(xù)應用于下一步測序 巢式PCR，可以在10的六次方基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，也不像二次PCR容易產(chǎn)生成片的產(chǎn)物，是效果最好的PCR，擴增質(zhì)量最高的PCR。 |
4樓2013-04-11 08:18:26
wangqi1107
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5樓2013-04-11 09:50:54
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