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蘆葦青青新蟲 (初入文壇)
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[求助]
急求��！ACC脫氨酶活性測定問題？？
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是這樣的~~~之前有師兄師姐分離出來的菌株測定出來是有ACC脫氨酶活性的，能很明顯的看到顏色對比，但是后來老師讓我重新測定的時候，同樣的方法再怎么測都測不出來，我想求教一下哪位做過這個實驗的大俠，這個實驗中有什么要特別注意的地方嗎？我已經(jīng)做了不下5次了,都快崩潰了。我下面貼出我的實驗過程。。。請大家指教一下。 酶活測定： Sample Text 供試菌株在5mLTSB 培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)2d后，8000 g ，4 ℃離心10min， Sample Text 重新懸浮于5mLDF 培養(yǎng)液，加入30uL0.5M的ACC母液，使得ACC終濃度為3.0mM（ACC在水溶液中不穩(wěn)定，因此過濾除菌后，保存在-20°C環(huán)境下)，室溫(21士1℃)振蕩培養(yǎng)2 d 后，8000 g ，4 ℃離心10min收集菌體； Sample Text. 用0.1 mol L-1 Tris-HCI 緩沖液（pH=7.6）洗滌三次，重懸浮于600 μL 0.1 mol L-1 Tris-HCI 緩沖液（pH=8.0）中，加入 30 μL 甲苯并迅速振蕩30 s 以破碎細(xì)胞，轉(zhuǎn)移200 μL含甲苯的細(xì)胞提取物，加入20 μL 0.5 M ACC 充分混勻；同時做不添加ACC 的空白試驗，30 ℃水育 15 min后，立即放置于冰浴環(huán)境中終止反應(yīng)；另取200uL在半小時內(nèi)完成蛋白測定（或放置于4°C環(huán)境下待測）； Sample Text 添加1 mL 0.56 mol L-1 HCl，簡單渦旋后，16 000 g，室溫下離心5 min，取 1 mL 懸浮液，加入800 μL 0.56 mol L-1 HCl 和300 μL 0.2%2，4-二硝基苯肼，充分混勻后30 ℃水育 30 min，加入 2 mL 2 mol L-1 NaOH，540 nm 測吸光度。 |
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3樓2018-05-03 21:27:40
東籬澤畔
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 13
- 帖子: 1
- 在線: 5分鐘
- 蟲號: 6640285
- 注冊: 2017-05-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物海洋學(xué)與海洋生物資源
2樓2017-06-30 22:24:13
4樓2018-07-23 10:16:24
5樓2018-07-23 10:20:36
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