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jessica_nn銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于重組蛋白包涵體的溶解及復(fù)性
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現(xiàn)在在做一個(gè)微生物誘導(dǎo)酶的研究，此酶誘導(dǎo)后主要以包涵體形式存在，現(xiàn)在想分離純化此酶，有沒有做過包涵體溶解及復(fù)性的高手可以指導(dǎo)下，具體應(yīng)該怎么做？怎么溶解包涵體，溶解后怎么復(fù)性？謝謝 |
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凌波麗
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jessica_nn: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-04-19 20:34:01
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包涵體溶解 我沒有空給你重新錄入，一會(huì)兒要去開會(huì)，我就把以前寫的拷貝一下。 一個(gè)Protocol:1.粉碎大腸桿菌，立新收集包涵體，加入0.01mmol/L PMSF（新鮮配制），50mmol/L(pH=8.0), 1mmol/L EDTA， 1mmol/LNaCl, 8mol/L,配成溶液，室溫作用約1小時(shí)，過程中可用手輕輕搖勻，一般不用上搖床。2.加入上述溶液的9倍體積的 50 mmol/L KH2PO4(pH=10)，1mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl, 室溫約30-40分鐘。第二步用NaOH將反應(yīng)體系的pH調(diào)至10，配置緩沖溶液時(shí)即做到，如不行再做后調(diào)整。3.用HCl 將溶液的pH調(diào)至約8.0，室溫30分鐘。4.在4攝氏度下，10000-13000rpm 離心 15分鐘或稍長(zhǎng)時(shí)間，收集上清液和沉淀。5.將上清液和沉淀于SDS-PAGE上樣緩沖溶液混合，100 攝氏度煮沸5-10分鐘，SDS-PAGE 電泳分析，觀察溶解效果。以上流程可以根據(jù)實(shí)際操作，適當(dāng)修改，也用6mol/L鹽酸胍對(duì)包涵體 進(jìn)行溶解，電泳前用透析或超濾去除掉鹽酸胍。 包涵體顆粒在溶解之前當(dāng)然可以機(jī)械粉碎，再加變性劑溶解，這是因?yàn)樵龃罅朔磻?yīng)的表面積，機(jī)械粉碎包涵體顆�？隙ㄓ蓄~外損失，但是目前包涵體變性后復(fù)性收率達(dá)不到30%以上，機(jī)械粉碎包涵體顆�？隙ㄓ蓄~外損失完全可以通過增加反應(yīng)速度和溶解率來加以補(bǔ)償。 |
2樓2013-04-15 14:53:02
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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另一個(gè)protocol: Purification of inclusion bodies and refolding of proteins http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html |
3樓2013-04-15 14:55:35
jessica_nn
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6樓2013-04-23 20:33:43
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