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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 相當熱心，還很詳細哦 2013-04-16 16:44:59
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PBS配制1L： NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4•12H2O 3.58g KH2PO4 0.27g 調(diào)pH至7.0-7.2,高壓滅菌 細胞周期檢測 (1) 細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，細胞近80%融合時傳代； (2) 制備細胞懸液：取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，吹打制成單個細胞懸液； (3) 細胞接種：細胞計數(shù)后以細胞數(shù)2×105個/孔接種到六孔板，加入適量的培養(yǎng)基至2mL/孔，靜置待細胞沉到板底后放入培養(yǎng)箱于37℃ 、5% CO2培養(yǎng)； (4) 藥物處理：細胞靜置培養(yǎng)24h，觀察細胞已完全貼壁后，分別給予不同濃度的藥物（DMSO含量為1‰），陽性對照組給予。。。。，陰性對照組給予同體積的DMSO，每個濃度設兩孔； (5) 收集細胞：培養(yǎng)48小時后用不含EDTA的胰酶消化細胞，并與原培養(yǎng)液一起離心收集細胞（4℃、1000g、5min），冰預冷的PBS重懸細胞并離心沉淀細胞； (6) 固定細胞：吸除上清液，可殘留約50μL，避免吸走細胞，邊震蕩邊加入1mL冰預冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻細胞，于4℃固定過夜； (7) 收集細胞：離心收集細胞（4℃、1000g、5min），用冰預冷的PBS重懸一次并離心沉淀細胞； (8) 細胞染色：吸除上清液，可殘留約50μL,避免吸走細胞，每個樣品加入0.5mL配好的染色液（含PI，RNA酶，染色緩沖液），緩慢并充分重懸細胞沉淀，于37℃避光溫浴30分鐘； (9) 上機檢測：染色完成后用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm處檢測紅色熒光。 流式細胞儀分析： (1) 按流式細胞儀操作規(guī)程開啟儀器，用FL2的熒光通道來采集PI的信號； (2) 取500μL樣本轉移到專用的流式上樣管，上機前輕輕彈擊試管底部混勻細胞，先用陰性對照組上機調(diào)試儀器； (3) 打開獲取實驗數(shù)據(jù)的軟件CellQuest，確定DDM門（doublet discrimination module，黏連體辨別模式）的參數(shù)是FL2； (4) 分別畫一個FSCvs.SSC散點圖、FL2-Wvs.FL2-A散點圖、FL2-A的直方圖； (5) DNA分析時，F(xiàn)SC、SSC和FL2都使用線性模式采集信號，調(diào)節(jié)FL2的電壓，使FL2-A的G1期細胞的峰位于200道數(shù)的位置上； (6) 實驗條件調(diào)節(jié)好后可以上機檢測，DNA檢測時最好用低速收。 |
2樓2013-04-16 15:42:07
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