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許老板金蟲 (小有名氣)
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[交流]
膠原蛋白的提取，我綜合的一個(gè)方案，麻煩大家看看，我有些疑問額。 已有6人參與
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膠原蛋白的提取 實(shí)驗(yàn)原料：豬皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸餾水。 實(shí)驗(yàn)器材：攪拌機(jī)，低溫離心機(jī)，控溫磁力攪拌器，電子天平，透析設(shè)備，PH試紙，燒杯，玻璃棒，小刀，研缽。 實(shí)驗(yàn)需配藥品：A:氯仿/乙醇（2:1）約需400ml， B:0.5mol/L乙酸約3000ml， C:6mol/L NaOH溶液約40ml, D:質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％、0.01％的乙酸（透析用）， E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl緩沖液約需200ml。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1,豬皮的前處理： （1）稱取豬皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液對(duì)其進(jìn)行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細(xì)切； （2）將組織小塊用乙醇和蒸餾水洗滌多次； （3）將洗滌后的組織放入攪拌機(jī)中攪拌成糊狀，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，E）充分洗滌（2h）以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取膠原蛋白： （1）進(jìn)行前處理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），攪拌并維持在4℃，提取48h； （2） 高速冷凍離心機(jī)離心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）攪拌過夜； （3）低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐級(jí)用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸計(jì)），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反復(fù)鹽析、酸溶。最后得到的上清液即為膠原粗提液。 3,膠原蛋白提純: （1）在粗提膠原蛋白溶液緩慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）調(diào)節(jié)pH值到7，冷凍離心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化鈉固體研細(xì)粉末，緩慢攪拌，4 ℃靜置過夜保存； （2）離心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，將溶解液裝入透析袋中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸餾水透析3d，每天換透析液兩次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水溶液； （3）將純化的膠原蛋白水溶液采用低溫冷凍干燥法制備成純膠原蛋白樣品，備用。 |
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許老板
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你的這一步完成以后就直接進(jìn)行透析了吧？還是要加NaOH什么的啊，我當(dāng)時(shí)看了你的這個(gè)之后吧我的方案改成了這樣： 實(shí)驗(yàn)步驟： 1,豬皮的前處理： （1）稱取豬皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液對(duì)其進(jìn)行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細(xì)切； （2）將組織小塊用乙醇和蒸餾水洗滌多次； （3）將洗滌后的組織放入攪拌機(jī)中攪拌成糊狀，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，E）充分洗滌（2h）以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取膠原蛋白： （1）進(jìn)行前處理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），攪拌并維持在4℃，提取48h； （2） 高速冷凍離心機(jī)離心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）攪拌過夜； （3）低溫離心，在沉淀中加入Tris中性液（F）攪拌使沉淀溶解，再加入NaCl至濃度為1.7M進(jìn)行鹽析，離心取上清液，加入NaCl至最終濃度為2.6M，離心取沉淀，溶于1%的乙酸(D)，4℃下靜置過夜，最后得到的上清液即為膠原粗提液。 3,膠原蛋白提純: （1）在粗提膠原蛋白溶液緩慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）調(diào)節(jié)pH值到6，冷凍離心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化鈉固體研細(xì)粉末，緩慢攪拌，4 ℃靜置過夜保存； （2）離心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，將溶解液裝入透析袋中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸餾水透析3d，每天換透析液兩次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水溶液； （3）將純化的膠原蛋白水溶液采用低溫冷凍干燥法制備成純膠原蛋白樣品，備用。 ————特別是第2（3）到后面的3，是不是有問題啊，我剛剛發(fā)現(xiàn)，我覺得照你的意思應(yīng)該是這樣的，你看對(duì)不對(duì)。 前面的一致，從2開始 2,提取膠原蛋白： （1）進(jìn)行前處理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），攪拌并維持在4℃，提取48h； （2） 高速冷凍離心機(jī)離心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）攪拌過夜； （3）低溫離心，在沉淀中加入Tris中性液（F）攪拌使沉淀溶解，再加入NaCl至濃度為1.7M進(jìn)行鹽析，離心取上清液，加入NaCl至最終濃度為2.6M，離心取沉淀，溶于1%的乙酸(D)，4℃下靜置過夜。 3，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸餾水透析3d，每天換透析液兩次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水溶液。將純化的膠原蛋白水溶液采用低溫冷凍干燥法制備成純膠原蛋白樣品，備用。 ————一定要看看，謝謝了，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)失敗，焦頭爛額的   |
22樓2013-05-20 19:08:14
許老板
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3樓2013-04-16 23:10:59
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
黃酮: 金幣+1, 謝謝回帖交流 2013-04-17 09:40:27
紅舟流星: 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎來生物材料板塊應(yīng)助交流 2013-04-17 11:45:07
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黃酮: 金幣+1, 謝謝回帖交流 2013-04-17 09:40:27
紅舟流星: 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎來生物材料板塊應(yīng)助交流 2013-04-17 11:45:07
| 加入氯化鈉個(gè)人認(rèn)為剛開始的濃度是鹽析，后幾步也是鹽析，但最后加鹽量少的時(shí)候是鹽溶；另外加氫氧化鈉是中和醋酸，必須加高濃度的是防止溶液體積過大，只能是少量多次滴加進(jìn)行控制。氯化鈉粉末的加入量個(gè)人覺得你只限于一片文獻(xiàn)，無法推斷，最好你多看幾篇文獻(xiàn)，在進(jìn)行設(shè)計(jì)，或者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。 |
4樓2013-04-17 05:36:53
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鐵桿木蟲 (正式寫手)
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5樓2013-04-17 12:58:43
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