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許老板金蟲 (小有名氣)
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[交流]
膠原蛋白的提取，我綜合的一個方案，麻煩大家看看，我有些疑問額。 已有6人參與
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膠原蛋白的提取 實驗原料：豬皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸餾水。 實驗器材：攪拌機，低溫離心機，控溫磁力攪拌器，電子天平，透析設(shè)備，PH試紙，燒杯，玻璃棒，小刀，研缽。 實驗需配藥品：A:氯仿/乙醇（2:1）約需400ml， B:0.5mol/L乙酸約3000ml， C:6mol/L NaOH溶液約40ml, D:質(zhì)量分數(shù)0.1％、0.01％的乙酸（透析用）， E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl緩沖液約需200ml。 實驗步驟： 1,豬皮的前處理： （1）稱取豬皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液對其進行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細切； （2）將組織小塊用乙醇和蒸餾水洗滌多次； （3）將洗滌后的組織放入攪拌機中攪拌成糊狀，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，E）充分洗滌（2h）以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取膠原蛋白： （1）進行前處理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），攪拌并維持在4℃，提取48h； （2） 高速冷凍離心機離心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）攪拌過夜； （3）低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐級用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸計），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反復鹽析、酸溶。最后得到的上清液即為膠原粗提液。 3,膠原蛋白提純: （1）在粗提膠原蛋白溶液緩慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）調(diào)節(jié)pH值到7，冷凍離心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化鈉固體研細粉末，緩慢攪拌，4 ℃靜置過夜保存； （2）離心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，將溶解液裝入透析袋中，用質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸餾水透析3d，每天換透析液兩次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水溶液； （3）將純化的膠原蛋白水溶液采用低溫冷凍干燥法制備成純膠原蛋白樣品，備用。 |
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