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forrestgump新蟲 (著名寫手)
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[求助]
能否抑制某一特地蛋白，基因敲除方法除外。
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各位老師： 最近準(zhǔn)備開題了，我們老板發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蛋白在血液含量特別高，就會的高血壓病，現(xiàn)在讓我做這項(xiàng)研究，可是我是剛?cè)腴T看的文獻(xiàn)特別少？我想請問有沒有專門針對某一種蛋白設(shè)計(jì)的可以抑制這種蛋白的功能的技術(shù)？記得以前有人說過PNA的可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)功能，請大仙們踴躍解答，不勝感謝！ |
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凌波麗
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silicare: 金幣+10, MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 辛苦了 2014-02-19 10:55:54
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silicare: 金幣+10, MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 辛苦了 2014-02-19 10:55:54
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剛要下線，看到你這貼，就說幾句了。 能否抑制某一特地蛋白，基因敲除方法除外，當(dāng)然knock in也就不說了，本質(zhì)一樣。siRNA,miRNA引起的基因沉默，有成型的protocols。siRNA可以通過降解mRNA和引起DNA的甲基化（招來一些DNA甲基化酶），還可以引起染色質(zhì)大片段的異染色質(zhì)化導(dǎo)致基因沉默。miRNA一般是在mRNA的5’末端，有時(shí)也在mRNA的3’末端形成空間位阻導(dǎo)致基因沉默。當(dāng)然siRNA,miRNA引起的基因沉默，肯定不是100%。另外還可以通過對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而使得其功能喪失，最常用的一個(gè)辦法，利用目的蛋白免疫小鼠后獲得單抗（具體實(shí)驗(yàn)步驟省略），然后用顯微注射入細(xì)胞類讓其與目的蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)，抑制目的蛋白質(zhì)的功能。還有：通過對目的蛋白質(zhì)加以點(diǎn)突變，改變其折疊狀態(tài)，以影響其生物功能。 下面舉個(gè)例子，是我回答別人的一個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)課題（研究某蛋白質(zhì)的功能）的全程設(shè)計(jì)，可以參考。 動物細(xì)胞的一種氧化還原酶在大腸桿菌中的表達(dá) 與在細(xì)胞中的定位（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與討論） 題目：用大腸桿菌表達(dá)來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶；并利用免疫熒光技術(shù)對細(xì)胞中的該蛋白進(jìn)行定位。答：這問題由我本人設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（方法還有很多種，我沒有都寫出來），但不是我的實(shí)驗(yàn)課題，是我在2012年的最后一天的晚上在“百度知道”（偶爾去了一趟） 回答內(nèi)蒙古大學(xué)某人的一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)問題，可我剛回答完，原問題就被撤消了（⊙﹏⊙b汗）。答案不是唯一的（疏漏之處歡迎斧正）。 這不難設(shè)計(jì)。 第一步，獲得來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的基因并且將其導(dǎo)入大腸桿菌。這就是分離基因，化學(xué)合成，cDNA文庫，mRNA篩選（比如DDRT，RDA，mRNA差異顯示技術(shù),削減雜交等），鳥槍法分離基因等等；然后導(dǎo)入載體 （質(zhì)粒，用表達(dá)載體好一些，因?yàn)橄劝演d體DNA整合到大腸桿菌的基因組不太容易，整合進(jìn)去高表達(dá)還要費(fèi)不少事情）；再將載體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞（比如氯化鈣 制備感受態(tài)大腸桿菌，使其轉(zhuǎn)化載體進(jìn)入其細(xì)胞），一般在其基因之前加上強(qiáng)啟動子。這步還包括陽性克隆篩選和分離，大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)品收獲就算了，不要粉碎細(xì) 菌，也不要構(gòu)成分泌蛋白質(zhì)，就讓目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)留在大腸桿菌細(xì)胞里。這一步就是完全依據(jù)基因工程的進(jìn)本步驟而設(shè)計(jì)。 第二步，獲得抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗體。單抗的制備方法，最粗糙的方法：小鼠腹水法。其實(shí)用多克隆抗體也可以，只是效果差一些。 第三步，給單克隆抗體標(biāo)記上可以發(fā)出熒光的基團(tuán)。熒光從哪來？給偶連蛋白質(zhì)標(biāo)記上能夠發(fā)出熒光的有機(jī)染料分子不就行了�；蛘咭部梢灾苯邮褂昧孔狱c(diǎn)熒光 法，量子點(diǎn)本身也就是靠其偶聯(lián)的抗體在細(xì)胞內(nèi)定位的。量子點(diǎn)制備與實(shí)驗(yàn)方法的原理與步驟可以參見Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。這一步也下一步密切信關(guān)，做得好下一步可以省很多事情。當(dāng)然也可以給把單克隆抗體的基因偶聯(lián)上綠色熒光蛋白的基因在大腸桿菌中一同表達(dá)，兩者之 間共價(jià)鍵鏈接，但是比較麻煩。 第四步，將用免疫熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗體進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中。給把單克隆抗體的基因偶聯(lián)上綠色熒光蛋白的基因在大腸桿菌中一同表達(dá)，兩者之間共價(jià)鍵鏈接，首先還要要把抗一種將抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克 隆抗體的基因分離出來導(dǎo)入大腸桿菌這也是一種實(shí)驗(yàn)方法，不過構(gòu)建基因，聯(lián)入DNA載體，導(dǎo)入細(xì)胞，陽性克隆篩選，工作量可不小，我是不這樣實(shí)驗(yàn)的，時(shí)效比 太低。還有其他的更簡單的實(shí)驗(yàn)方法：直接從蛋白質(zhì)水平動手。從外界導(dǎo)入帶有熒光標(biāo)記的抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗體蛋白質(zhì)，這又可以有好多種辦 法：一種顯微注射法，對實(shí)驗(yàn)人員的操作水平要求推高，而勞動量大，像我這樣的懶人絕對不干（給錢也不干）；第二種方法讓細(xì)胞內(nèi)吞攝入蛋白質(zhì)，然后把抗來源 于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗體一起拉入細(xì)胞（去查一下大腸桿菌內(nèi)吞哪些蛋白質(zhì)），當(dāng)然要把大腸桿菌內(nèi)吞蛋白質(zhì)與抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原 酶的單克隆抗體共價(jià)鏈接在一起。怎么連？再做個(gè)融合蛋白的基因去表達(dá)出來？那多累呀，像我這樣的懶人絕對不干（給錢也不干），誰像這樣實(shí)驗(yàn)誰就去做，反正 我絕對拒絕如此實(shí)驗(yàn)（不當(dāng)?shù)退絼趧恿Γ�，可用分子交�?lián)方法-------用有機(jī)試劑把兩者用化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)到一起不就行了嗎，有空間位阻，加個(gè)鏈接臂行了 吧，比如可以先用EDC、戊二醛等試試看，去查一下與抗體工程和酶的固定化相關(guān)的Methods inMolecular Biology ，Methods in Enzymology系列的實(shí)驗(yàn)手冊。分子交聯(lián)方法當(dāng)然會出很多的混合物，用層析篩選一下，在檢測一下活性，適當(dāng)控制和調(diào)整反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件，得到陽性 結(jié)果不難。熒光從哪來？給偶連蛋白質(zhì)標(biāo)記上能夠發(fā)出熒光的有機(jī)染料分子不就行了�；蛘咭部梢灾苯邮褂昧孔狱c(diǎn)熒光法，量子點(diǎn)本身也就是靠其偶聯(lián)的抗體在細(xì)胞 內(nèi)定位的。量子點(diǎn)制備與實(shí)驗(yàn)方法的原理與步驟可以參見Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。第三步和第四步實(shí)際上很難說誰先誰后，我是為了說明清楚人為分開的。 第五步，單抗與來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶（抗原）相互作用。抗原與抗體相互作用并不困難，但是在細(xì)胞中要注意必須使得兩者在同一個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中。因?yàn)檫@題是在大腸桿菌中，沒有細(xì)胞器，也就不必再給當(dāng)克隆抗體連接上 進(jìn)入各個(gè)封閉性的細(xì)胞器的信號肽序列，比如進(jìn)入線粒體或者葉綠體或溶酶體等特異性信號肽序列。如果原問題問的是確定大腸桿菌表達(dá)的來源于動物細(xì)胞的某一氧 化還原酶在大腸桿菌的細(xì)胞的具體部位，那么這步實(shí)際上就省略了；如果原問題問的是確定大腸桿菌表達(dá)的來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶在原來表達(dá)它的動物細(xì) 胞中的具體部位，那么給單抗的氨基端接上信號肽或者信號斑（后者不在氨基端）可能就是需要的（第六步再解釋為什么即使對于真核的動物細(xì)胞也不是必須要給單 抗接上信號肽和信號斑）。給單抗接上信號肽和信號斑用融合蛋白當(dāng)然是可行的，但是工作量又大了，有沒有更爽的試驗(yàn)方法？當(dāng)然有！請看第六步， 第六步，確定大來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶在大腸桿菌的細(xì)胞和在原來表達(dá)它的動物細(xì)胞中的具體部位（原題沒有說清楚，所以對兩種細(xì)胞都要討論）。 1.確定大腸桿菌表達(dá)的來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶在大腸桿菌的細(xì)胞的具體部位。給予大腸桿菌細(xì)胞外界光源，使導(dǎo)入的熒光基團(tuán)發(fā)出特異性波長的熒光， 用熒光顯微鏡直接觀察熒光所在細(xì)胞的亞細(xì)胞部位，并拍照可確定大腸桿菌表達(dá)的來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶在大腸桿菌的細(xì)胞的具體部位。 2.確定來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶在原來表達(dá)它的動物細(xì)胞內(nèi)的具體部位。按第五步構(gòu)成融合蛋白質(zhì)當(dāng)然是可以的，但是等于把第一步的工作有對抗源于動 物細(xì)胞的某一氧化還原酶的基因基本上又重復(fù)了一遍，工作量大也沒有太大必要。但是在氨基端共建連接上一段信號肽，用有機(jī)合成合成方法（比如用EDC催化氨 基與羧基縮水構(gòu)成新的肽鍵，雖然副反應(yīng)不少，但是反應(yīng)條件溫和，效率高，用層析分離收獲到所需產(chǎn)品并不難，可是信號斑在肽段中間，再用有機(jī)合成先切開再插 入信號斑序列，然后還要連接，每一步都有副反應(yīng)，每一步都要分離提純，還涉及到重折疊，即使能夠做成，勞動量比融合蛋白絕對不小。 那怎么辦？既然困難很大，那么就另辟蹊徑，從別的實(shí)驗(yàn)途徑達(dá)到目的。做好了有熒光染料標(biāo)記的抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗體，不再加工了； 而轉(zhuǎn)向加工原來表達(dá)“來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶”的動物細(xì)胞本身·， 將該種動物細(xì)胞粉碎，然后分級分離提純細(xì)胞不同成分，比如離心、層析，不用太多的分離純化，對膜性封閉細(xì)胞器還是必須能夠彼此分開，因?yàn)橐右愿髯苑鬯椋?膜性封閉細(xì)胞器混在一起被粉碎就不知道液相提取液的具體來源了。然后分別對于不同提取液加入有熒光染料標(biāo)記的抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗 體，進(jìn)行免疫沉淀。發(fā)生沉淀后收集免疫沉淀物，因?yàn)榭梢允孪扔梅亲冃苑肿雍Y層析測出單抗與目的酶混合物的相對分子量，再給予不同提取液加入有熒光染料標(biāo)記 的抗來源于動物細(xì)胞的某一氧化還原酶的單克隆抗與其抗原的復(fù)合物給予外界光源，使單抗偶聯(lián)的熒光染料發(fā)出特定波長的熒光，進(jìn)而用熒光顯微鏡觀測，是陽性結(jié) 果的提取液是目地酶的來源的亞細(xì)胞定位處。如果免疫沉淀物中的熒光有機(jī)染料不能夠有效吸收外界光源并且激發(fā)熒光，可以適當(dāng)加入中性鹽溶液，比如氯化鈉，拆 解開免疫復(fù)合物，并適當(dāng)稀釋。因?yàn)橛袩晒怙@微鏡的直接觀測，所以免疫沉淀可以做的稍微比較粗糙。 實(shí)際上，還有很多種實(shí)驗(yàn)方法，有很多實(shí)驗(yàn)方法不必使用免疫熒光，可能還更加簡單。 Good Luck! 我只是拋磚引玉，并不是說我的上面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案就是最好的，更不是唯一的。 提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力，除了學(xué)習(xí)基本的實(shí)驗(yàn)原理和基礎(chǔ)理論知識外，還要注意課本中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的基本設(shè)計(jì)方法，但是這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，可能的話要看些實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。 在自己有條件做實(shí)驗(yàn)時(shí)多動手多思考，而不是照貓畫虎的臨摹一遍；沒有條件自己動手時(shí)可以仔細(xì)思考關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)總體過程，把大的問題逐漸分解為小的問題，再根 據(jù)掌握的知識去試圖能夠用一些實(shí)驗(yàn)手段對小的問題加以實(shí)驗(yàn)操作性的解決，并且要考慮小的問題的解決是在解答大的問題過程中起到了什么具體的作用。閱讀SCI原始論文是必要的，但是沒有學(xué)好基本的基礎(chǔ)理論知識和基本的實(shí)驗(yàn)原理，看多少論文都是用海市蜃樓來炒作房地產(chǎn)，比房地產(chǎn)泡沫還玄虛。僅僅熟悉教 材上的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)沒用！--------我沒有讓誰完全不去看經(jīng)典實(shí)驗(yàn)！實(shí)驗(yàn)技術(shù)早就超越了教材上的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的時(shí)代，不接觸一些現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)，沒有可能 提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力-----------無論在考試中，還是在科研工作中。 |
2樓2013-04-18 00:07:36
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【答案】應(yīng)助回帖
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forrestgump: 金幣+1 2013-04-18 16:02:47
forrestgump: 金幣+1 2013-04-18 16:02:47
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當(dāng)然，通過抑制所研究的功能蛋白質(zhì)的上下游的活性也可以達(dá)到抑制目的蛋白質(zhì)的功能的作用。通過上面的實(shí)驗(yàn)的全程設(shè)計(jì)的舉例，雖然不是直接與樓主的課題有關(guān)，但是有關(guān)的是研究技術(shù)是相通的。另外，基因的異位表達(dá)也是一種重要的研究基因功能的方法，比如iPS cell中應(yīng)用就非常明顯。調(diào)出目的蛋白質(zhì)的上下游蛋白質(zhì)然后對上下游者加以修飾或者抑制也是抑制目的蛋白的功能的方法。 另外，讓目的蛋白質(zhì)的基因多加上些序列，引起其折疊形態(tài)改變，進(jìn)而引起功能或細(xì)胞定位改變也能夠抑制正常功能的發(fā)揮。所由以上的各種方法，都可以先在細(xì)胞水平上實(shí)驗(yàn)（原核真核細(xì)胞是需要而定），也就可參考我舉的例子的試驗(yàn)流程。呵呵。。。我上貼沒有跑題。。。。  |
3樓2013-04-18 00:19:28
starseacow
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4樓2013-04-18 05:00:14
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