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cjf-88銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
兩種重組質(zhì)粒的重新構(gòu)建問(wèn)題
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有兩個(gè)質(zhì)粒：pEGFP-N3質(zhì)粒和PET-28a質(zhì)粒，想從pEGFP-N3質(zhì)粒中獲得EGFP基因并 將其導(dǎo)入到PET-28a質(zhì)粒中重新構(gòu)建表達(dá)載體——PET-28a-EGFP并表達(dá)綠色熒光蛋白，有文獻(xiàn)以EGFP基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得目的基因，并將經(jīng)純化的目的基因?yàn)槟０澹僭O(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增得到引入酶切位點(diǎn)的目的基因；另外將PET-28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切．經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，切下線性質(zhì)粒條帶進(jìn)行純化回收。 我想問(wèn)的是：為什么要將PET-28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化DH5α后再重新提取質(zhì)粒，而不是直接將PET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切？是怕質(zhì)粒的量不夠嗎？還是有其他原因？另外，假如我想直接通過(guò)雙酶切從pEGFP-N3質(zhì)粒中獲得整段的EGFP基因，再用相同的雙酶切體系對(duì)PET-28a質(zhì)粒進(jìn)行酶切，最后再將其重新連接起來(lái)獲得新的重組質(zhì)粒，在網(wǎng)上看到賣的質(zhì)粒規(guī)格一般是2ug，是否夠用呢？是否需要分別將pEGFP-N3質(zhì)粒和PET-28a質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH5α后再分別重新提取質(zhì)粒？還是可以直接將這兩種質(zhì)粒進(jìn)行酶切？ 由于沒(méi)有做過(guò)分子生物方面的實(shí)驗(yàn)，有很多不懂的地方，麻煩高手幫幫忙，謝謝大家了！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cjf-88: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 謝謝！ 2013-04-20 10:47:22
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cjf-88: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 謝謝！ 2013-04-20 10:47:22
| pET28a是表達(dá)載體，一般是保存在BL21(DE3)菌株里，用于表達(dá)蛋白。這些蛋白表達(dá)菌株不是recA-，制備質(zhì)粒和長(zhǎng)期保存質(zhì)粒最好轉(zhuǎn)化到DH5α，再提取質(zhì)粒。當(dāng)然，如果你手頭已經(jīng)有足夠量的pET28a質(zhì)粒，可以直接做酶切。購(gòu)買質(zhì)粒后一般不會(huì)直接用掉，都是轉(zhuǎn)化到DH5α里根據(jù)需要的規(guī)模提取質(zhì)粒。這樣也不需要重復(fù)購(gòu)買質(zhì)粒。如果有可能的話，你可以與其他實(shí)驗(yàn)室交換質(zhì)粒或者直接要。當(dāng)然，2μg的質(zhì)粒做酶切也是夠用的。 |
2樓2013-04-20 05:34:03
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