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西瓜豬1007鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
測胡蘿卜多酚氧化酶遇到的問題
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前陣子測胡蘿卜多酚氧化酶活的時候遇到了如下問題： 1. 當我把酶液和底物混合在比色皿中以后，一開始吸光值正常的慢慢變大，再反應(yīng)一會，吸光值逐漸變小，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液開始分層。請教為什么反應(yīng)液會分層。。。好糾結(jié)。。。 2. 實驗室沒有冷凍離心機，提取酶液的時候不冷凍離心會怎么樣。。。 3. 看文獻人家做實驗會加PVP，這個東西的作用到底是什么？防止PPO氧化？每次做實驗加PVP以后，反應(yīng)液一旦混合顏色就好白好白。。吸光值太大了。。。 我的反應(yīng)體系是0.5ml酶液+3ml底物（0.5M鄰苯二酚溶于pH6.5 0.2M的磷酸緩沖液） 2013-04-13 17.04.57.jpg |
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12樓2013-04-27 14:25:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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1. 粗酶液的制備 稱取馬鈴薯塊莖5g于研缽中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸餾水浸洗，然后過濾以除去雜質(zhì)）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸緩沖液,磨成勻漿，用幾層紗布袋過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，離心除沉淀，上清液再加硫酸銨使達60％飽和度，離心收集沉淀。將所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸緩沖液中，即為粗制酶液。 2. 活性酶的測定 在試管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸緩沖液，1.0ml 0.1 mol•L－1兒茶酚在37℃恒溫水浴中保溫10min ，然后加入0.5ml酶液（可視酶活性增減用量），迅速搖勻，倒入比色杯內(nèi)，于525nm波長處以時間掃描方式，在1～2min內(nèi)測定吸光度變化（A）值。 五、酶活性的計算 以每min內(nèi)A525值變化0.01為1個酶活力單位，按下式計算多酚氧化酶的活力和比活性。 A 酶提取液總量（ml） 酶活力（0.01A•min－1）＝———————×——————————— 0.01×反應(yīng)時間 測定時酶液用量（ml） A 酶提取液總量（ml） 酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×—————————— 0.01×W×反應(yīng)時間 測定時酶液用量（ml） 公式中：A — 為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值；W為樣品鮮重（g）。你按這個試一試，不行在交流 |
3樓2013-04-23 22:37:36
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