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畢赤酵母轉(zhuǎn)化后遺傳霉素篩選問題
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| 大家好，這次做了一次酵母的點轉(zhuǎn)化實驗，GS115菌株，ppic9k質(zhì)粒，先在MD平板上長起來之后，方法一：用牙簽挑上幾十個單克隆轉(zhuǎn)移到0.5mg/ml的遺傳霉素G418平板上進行第一個濃度的初篩，3天了，還沒東西，著急�。。�！方法二：用無菌水把MD平板上的菌落洗下來，然后涂在0.5mg/ml的遺傳霉素G418平板上，這里我想問一下涂G418平板時菌濃度是不是要特別注意，遺傳霉素對細胞密度很敏感？？？？？ |
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cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
cuicchao(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-04 19:28:28
cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
cuicchao(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-04 19:28:28
| 補充一下，其實第二種洗平板的方法也是有其優(yōu)勢的，挑單克隆畢竟不能將所有高拷貝轉(zhuǎn)化子一網(wǎng)打盡，這是挑單克隆的弊端，往往很可能你會錯過那些最高拷貝的克隆，而洗脫后涂布，只要你G418梯度設(shè)置合理、寬泛，就一定能篩到最高拷貝的克隆，我們實驗室就是這么做的。第一種方法當(dāng)然會比較純，這個確實是一個優(yōu)勢；但，絕大部分用畢赤酵母表達系統(tǒng)的實驗都是為了得到高拷貝，這是最終極的目標(biāo)；不過，如果樓主有足夠的耐心與時間，還有足夠的G418，完全可以把所有克隆都挑出來，但這個確實很費時費力。兩種方法各有優(yōu)缺點，不能一概而論，更不能執(zhí)其一端，要依實際情況靈活選擇應(yīng)用。 |
9樓2013-05-04 11:51:25
★ ★
cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，鼓勵應(yīng)助，分子生物版塊期待你的更多精彩。同樣期待你更詳細的應(yīng)助指導(dǎo)。 2013-05-02 12:04:15
cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，鼓勵應(yīng)助，分子生物版塊期待你的更多精彩。同樣期待你更詳細的應(yīng)助指導(dǎo)。 2013-05-02 12:04:15
| 可以嘗試不同濃度的G418平板，0.25mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,我們實驗室都做到2.0,3.0mg/L,高抗的一般長的是比較慢，可以第四天查看一下。另外建議挑轉(zhuǎn)化平板克隆，不建議涂菌液，因為嚴格意義上講涂菌液長出來的克隆同一克隆幾率會比較大，就是說一個轉(zhuǎn)化平板上的高拷貝克隆可以在G418長出N個克隆，篩選就失去了意義 |
5樓2013-05-02 11:05:17
6樓2013-05-02 11:23:09
7樓2013-05-02 14:23:47
簡單回復(fù)
gzl99013樓
2013-05-01 13:26
回復(fù)
cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
祝福祝福祝福祝福祝福祝福！
夢想天行13樓
2016-11-12 14:57
回復(fù)
cuicchao(金幣+1): 謝謝參與
， 發(fā)自小木蟲Android客戶端
夢想天行14樓
2016-11-12 14:57
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