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iamvivien新蟲 (初入文壇)
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[求助]
western結(jié)果跟考馬斯蘭，質(zhì)譜結(jié)果不符合！
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化學(xué)背景的生物新人跪求大家指點！��！是這樣的，合成的drug固定到dynabeads上面后，跟空白組blank beads對照跑膠，然后找出特異蛋白帶，跑了質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)一個已知應(yīng)該結(jié)合的蛋白，特異性結(jié)合到我的probe上面，這個實驗重復(fù)做了多遍，一直特異性很好，沒有在空白beads上面發(fā)現(xiàn)。然后訂了此蛋白的一抗，然后又重復(fù)實驗，western結(jié)果讓我真的哭了出來。。。空白組跟實驗組都有一個很明顯的band！ 考馬斯蘭染色的時候也是發(fā)現(xiàn)空白組有非特異結(jié)合，但是明顯實驗組band更intensive! 然后查了很多資料，說western的一抗敏感度強(qiáng)，可以檢測pg的蛋白，但是質(zhì)譜要至少ng的蛋白量才能檢測到，是不是有這種可能，我的蛋白結(jié)合空白組但是不如我的實驗組強(qiáng)，并且空白組的結(jié)合蛋白量不能夠被質(zhì)譜檢測出來（小于ng），而western實驗太敏感，這樣空白組跟實驗組的蛋白都檢測出來了？我用的一抗可能濃度也太高，用了1：100，第一次做防止檢測不出來。。。但是一抗的特異性不錯，就一條蛋白band。但是非常非常強(qiáng)的信號。。還有我的上樣量如果很大程度的稀釋，可以減少非特異結(jié)合么？現(xiàn)在疑問就是還有沒有希望試一下稀釋一抗，稀釋上樣量，然后能至少看出量的區(qū)別呢？我覺得pg就可以檢測出來的話，western很難能分出blank跟實驗組的區(qū)別吧？有點崩潰，特別崩潰！希望大家指點�。。。。�！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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iamvivien(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-09 20:53:10
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iamvivien(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-09 20:53:10
| 你在抗體孵育的牛奶或者BSA用量和時間是否足夠，個不清洗過程是不是足夠。因為抗體-抗原相互作用的接觸面積一般是1500-1700平方埃，而一個氨基酸殘基的表面積是100-200平方埃，所以如果另個抗原的免疫決定簇正好有6-8個氨基酸殘基序列相同，存在交叉反應(yīng)的可能是存在的。所以，你可以適當(dāng)稀釋二抗的濃度先試試，不行在稀釋一抗和樣品濃度。 |
2樓2013-05-09 14:21:01
iamvivien
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感謝回復(fù)！我二抗是1：10000的濃度。BSA用的是3% in TTBS, block了過夜，在四度。一抗是3小時，室溫，1：100 in 3% BSA, 然后rinse了兩遍后，再用TTBS洗了三遍，每次10分鐘，然后加的二抗，一小時室溫，1：10000 in TTBS， 最后洗的時候也是先rinse，再三遍的十分鐘。買的一抗上面說是N端的2-33個氨基酸。有另外一個蛋白我在空白組的質(zhì)譜上面發(fā)現(xiàn)過，可能不是特異蛋白，是同一個family的，序列重合度跟我的目標(biāo)蛋白很高。。。。就是有可能識別的是另外這個蛋白？但是這樣的話至少應(yīng)該看到兩條蛋白帶吧？不過這兩個蛋白一上一下，大小很接近。可能我的蛋白帶太濃，很粗，完全分不清楚也有可能。。。 二抗您覺得應(yīng)該稀釋到多少呢？ |
3樓2013-05-09 15:54:12
凌波麗
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iamvivien: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-05-22 08:08:09
iamvivien: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-05-22 08:08:09
| 我見到實驗手冊，一抗和二抗都可以稀釋到1:100-1:15000 |
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2013-05-09 16:10:23, 10.74 M
4樓2013-05-09 16:03:01
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