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哆啦B夢(mèng)1024銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
純化后蛋白沒活性，試過很多方法都不行啊~~~
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| 各位親愛的蟲友，我過鎳柱純化蛋白，之前出現(xiàn)的問題是冷凍干燥后的蛋白粉末不溶，嘗試透析后不凍干成粉末，直接在溶液里，然后濃縮了一下，發(fā)現(xiàn)還是沒有活性。在網(wǎng)上看見有說純化后蛋白里面如果有核酸要用DNA酶去掉，但是我不太明白核酸的存在會(huì)對(duì)酶活有影響嗎？是什么原理��？另外，我準(zhǔn)備把組氨酸標(biāo)簽用凝血酶去掉，想再試一下這個(gè)~ 各位蟲友有啥經(jīng)驗(yàn)不吝賜教�。。ㄔ谧鲞@個(gè)的同時(shí)已經(jīng)準(zhǔn)備換載體了，用PET22b（+）……） |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
哆啦B夢(mèng)1024(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-09 20:52:23
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那你在(his)6與目的蛋白質(zhì)之間構(gòu)建一個(gè)5個(gè)親水氨基酸構(gòu)成的酶的切點(diǎn)吧，比如凝血酶的專一性切點(diǎn)，然后過柱時(shí)用凝血酶的洗脫液切斷(his)6標(biāo)簽進(jìn)行純化吧。 核酸影響對(duì)酶活性很正常，兩者形成了非共價(jià)的聚集體的話，使得酶的構(gòu)象僵化，進(jìn)而使酶的誘導(dǎo)契合會(huì)受限制甚至不可能；酶的底物通道會(huì)被核酸堵住使底物無(wú)法接近酶；核酸線狀親水長(zhǎng)鏈分子，與酶結(jié)合后會(huì)改變酶的分子表面的微環(huán)境-----包括活性中心附近的微環(huán)境。 要去掉核酸，可用陰離子交換色譜柱。 |
2樓2013-05-09 15:41:26
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
| 核酸影響對(duì)酶活性的原理參考：【荷蘭】曹荻秋(Linqiu Cao) 著，楊晟、袁中一 譯，載體固定化酶----原理、應(yīng)用和設(shè)計(jì)，化學(xué)工業(yè)出版社，2008，我借鑒了酶的固定化介質(zhì)對(duì)已酶活性的影響，在敘述上我結(jié)合酶學(xué)原理做了少量補(bǔ)充，把酶的固定化介質(zhì)對(duì)已酶活性的影響的原理應(yīng)用到核酸對(duì)酶的活性影響上，如此應(yīng)用的理論基礎(chǔ)是酶的催化原理，后者我就不列出文獻(xiàn)了。----------你要的話，可以告訴你。 |
3樓2013-05-09 16:37:31
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