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任天青金蟲 (小有名氣)
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[求助]
為什么膜蛋白不能鹽析沉淀
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請問大牛，為什么膜蛋白的粗分離不能用鹽析沉淀法�。课宜阉髁烁鞔鬄g覽器，均沒有發(fā)現(xiàn)用鹽析發(fā)粗分膜蛋白的說法(大都用的超高速離心發(fā))。小弟想知道其中原因何在？還是他們顧及到了后續(xù)的透析比較浪費(fèi)非離子型去垢劑？ PS： 最近小弟在提取一種含顏色標(biāo)記的蛋白， 而且并不知道它是屬于膜蛋白還是漿蛋白，但通過下一個(gè)實(shí)驗(yàn)我覺得它可能是膜蛋白： 1）一開始按照可溶性蛋白的常規(guī)步驟（勻漿，鹽析）來處理，但發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的得率不高（無論是勻漿后的上清還是鹽析后的沉淀中） 2）后面我在勻漿液中加入了1% tritonX-100，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的得率得到了可觀的表現(xiàn) 3）但加入了1% tritonX-100的勻漿上清（10000g×20min，除去未破細(xì)胞和細(xì)胞大碎片，上同），加入硫酸銨將其飽和度調(diào)至30%后，發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白不是沉淀在管底，而是聚集并漂浮在液面上。(這個(gè)原因還不清楚，師兄說是變性了。莫非這就是鹽析沉淀膜蛋白不行的原因？) 不慎感激�。。� [ Last edited by 任天青 on 2013-5-13 at 11:26 ] |
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| 個(gè)人建議：1. 你加入1% 曲拉通，蛋白得率提高，其實(shí)并不能說明他是膜蛋白還是胞內(nèi)蛋白。因?yàn)槟闾崛〔襟E是勻漿……，并不能很好的使細(xì)胞膜破裂，加入表面活性劑，能進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜，所以能更多釋放胞內(nèi)蛋白，所以并不能說明是膜蛋白還是胞內(nèi)蛋白。2. 膜蛋白沒有去垢劑的溶解是提取不出來的，能提取的，那是膜相關(guān)蛋白或錨釘?shù)鞍住?. 不用硫酸銨沉淀是因?yàn)槟さ鞍撞荒艹恋�，普通蛋白沉淀了之后可以再溶解，膜蛋白不能溶解了。因�(yàn)槟さ鞍自谒惺遣蝗艿�，做膜蛋白要考慮如何增溶。4. 加入硫酸銨之后漂浮在液面上，個(gè)人覺得可能和曲拉通有關(guān)，高濃度的硫酸銨奪取水分子，使曲拉通聚集形成大的膠束�？赡芮ò愕牡鞍谆蚱渌椭捎诿芏刃�，而漂浮在液面上。另外，加表面活性劑不用硫酸銨沉淀還有個(gè)原因。硫酸銨奪取蛋白表面與之結(jié)合的水分子，使蛋白內(nèi)部疏水殘基暴露，聚集沉淀下來，這時(shí)候要是有去垢劑的存在，去垢劑疏水部分會與蛋白質(zhì)疏水殘基相互作用，從而使蛋白質(zhì)變性。但是由去垢劑作用的蛋白并不是大量聚集沉淀，而是由去垢劑將其分散，是分散的蛋白，并不會形成顆粒很大的沉淀，由于密度較硫酸銨溶液的小，所以漂浮在溶液上面。個(gè)人建議，僅供參考。 |
2樓2013-05-14 23:01:25
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wizardfan: 金幣+5, 謝謝分析，以后常來 2013-05-16 07:22:55
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樓主！我關(guān)注這個(gè)話題很久了，看一直沒有人給你回復(fù)，我就說點(diǎn)吧！其實(shí)我懂的也不多，只是大概知道點(diǎn)理論知識！希望能對你有用��！ 首先，膜蛋白純化在學(xué)術(shù)界一直是比較困擾的問題！一般的純化方法并不能獲得你要的膜蛋白，可能比較困難！ 1. 由于膜蛋白的過表達(dá)可能對細(xì)胞有毒性， 2.在純化時(shí)很難選擇合適的溶解試劑，不同的去污劑，它的助溶效果都不一樣！（與可溶性蛋白不同，膜蛋白具有單重或多重跨膜結(jié)構(gòu)容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致膜蛋白很難溶解。目前常用的方法就是去污劑進(jìn)行膜蛋白的溶解。去污劑同時(shí)具有疏水和親水區(qū)域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污劑的復(fù)合物，從而可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化。） 先回答你的PS的問題，你開始的問題我會另起一樓！ 我不建議你用硫酸銨的方法來獲取膜蛋白，可能正如樓上所說！ 1.建議你用水溶性的蛋白層析技術(shù)，他也是可以用于膜蛋白的純化，例如IMAC的親和層析，分子篩，離子交換！ 2.每步純化都需要添加去污劑，所以很消耗去污劑！成功的關(guān)鍵在于1）.你去污劑種類的選擇，不一定非選tritonX-100，其他的也試試！SDS,CHAPS and so on;2). 最佳pH的選擇和鹽濃度的選擇，都會影響你膜蛋白純化得到的純度！ 3.why我要添加去污劑？因?yàn)槿ノ蹌┧嬖贑MC（臨界膠束濃度）！如果不懂，可以上網(wǎng)search一下！ 這一樓就這么多吧！多了可能你也不會看！ |
3樓2013-05-15 10:54:52
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任天青(wizardfan代發(fā)): 金幣+40, 謝謝參與 2013-05-22 07:35:12
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1. 采用超速離心的方法，也是分布離心的！根據(jù)每種物質(zhì)不同的沉降系數(shù)來采用不同的離心率，從而達(dá)到分離的效果！ 2. 為何后續(xù)的透析比較浪費(fèi)非離子型去垢劑？因?yàn)橥肝龅捏w積較大！所以你添加的非離子型去垢劑量就多！其實(shí)不一定非要選擇非離子型去垢劑，非離子型去垢劑不一定是做好的選擇，其他的種類去污劑也可試試！ 好吧，就這么多吧！希望對你有用！ |
4樓2013-05-15 11:12:11
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wizardfan: 金幣+5, 感謝進(jìn)一步的分析 2013-05-16 08:02:42
任天青(wizardfan代發(fā)): 金幣+40, 謝謝參與 2013-05-22 07:34:51
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任天青(wizardfan代發(fā)): 金幣+40, 謝謝參與 2013-05-22 07:34:51
| 你80個(gè)金幣太誘人了，不得不讓我再回復(fù)一下你的帖子。你說常規(guī)可溶蛋白提取，得率不高，加曲拉通得率提高�？梢钥隙ǖ恼f你的蛋白不是膜蛋白，因?yàn)槟さ鞍兹绻麤]有去垢劑的提取是提取不出來的。你的蛋白可能是胞內(nèi)蛋白或膜相關(guān)蛋白或錨釘?shù)鞍住＜热荒愕牡鞍子们芴崛〕鰜�，那么我覺得可以這么往下做:1. 透析掉曲拉通，硫酸銨沉淀。2. 你硫酸銨沉淀的目的是濃縮目的蛋白，其他方式也可以達(dá)到此目的，比如超濾，提取液比較多的話，有大的超濾裝置。當(dāng)然，還是透析掉曲拉通的好。因?yàn)槟悴患忧ǖ臅r(shí)候蛋白能提取出一些，只是量少，說明沒有曲拉通蛋白還是可溶的，所以我覺得透析掉曲拉通不會影響蛋白的溶解性。你試驗(yàn)中的漂浮在液面上的現(xiàn)象可以這么解釋：蛋白溶解在1%的曲拉通中，曲拉通的疏水端會與蛋白表面的疏水部分相互作用。這個(gè)濃度下的曲拉通不會使蛋白變性。加入高濃度硫酸銨，硫酸銨競爭結(jié)合水分子，使得曲拉通膠束濃度變大。曲拉通聚集。此時(shí)曲拉通的濃度比1%要高。高濃度的曲拉通會使得蛋白質(zhì)變性。變性的蛋白并不會聚集沉淀，變性后的蛋白在曲拉通的作用下變?yōu)閱畏稚⒒蛘叨喾稚�，但不會聚集成更大的聚集體以沉淀下來。曲拉通親水的頭部與硫酸銨溶液液面作用，曲拉通蛋白溶液密度小，浮在溶液表面。膜蛋白是不會用硫酸銨沉淀的。原因很多，硫酸銨沉淀一般都要求蛋白的量比較多，而膜蛋白能提取出一點(diǎn)都很費(fèi)勁，所以不會用硫酸銨沉淀這種方法，膜蛋白的表達(dá)也很燒錢，所以會選擇直接親和純化。膜蛋白想要得到沉淀只需要將去垢劑的濃度降低即可，不需額外加入其它東西。您的蛋白不是膜蛋白，是胞內(nèi)蛋白或者膜相關(guān)蛋白。加曲拉通能提高你的得率很可能是你破細(xì)胞不完全，因?yàn)槟阌玫姆椒ㄊ莿驖{，超聲等等，破的不完全。沒有曲拉通也能提取你的蛋白，證明曲拉通對蛋白的穩(wěn)定性影響不大，可以在你提取出來之后將其除去在做下面試驗(yàn)。除去曲拉通除了透析等方法外，還可以在正常鹽濃度下過疏水柱，蛋白不結(jié)合，去垢劑由于疏水端會與柱子相結(jié)合。給點(diǎn)金幣吧，打字不容易。 |
5樓2013-05-15 17:04:11
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