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含羞草liu新蟲 (小有名氣)
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[求助]
如何去除RNA提取過程中的蛋白質(zhì)污染
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大家好！我目前正在構(gòu)建cDNA文庫，需要高質(zhì)量的RNA。提取的材料是楊樹葉片，最先我是用Trizol 提取的，提取到的RNA對(duì)OD值檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OD260/OD280的范圍在1.8~2.0之間，但電泳檢測(cè)時(shí)加樣孔總會(huì)發(fā)亮，也就是會(huì)有蛋白質(zhì)的污染，直接用此法提取的RNA構(gòu)建文庫時(shí)總是很不理想。后來，我在takara 購買了RNAiso 試劑配合Fruit-mate試劑進(jìn)行提�。ㄟ@兩種試劑是針對(duì)多糖多酚植物材料的），提取后檢測(cè)，OD260/OD280的范圍在1.8~2.0之間，但電泳時(shí)加樣孔也會(huì)發(fā)亮，此法也不能有效的去除蛋白質(zhì)。之后，我對(duì)Trizol提取后的RNA進(jìn)行LiCL沉淀，配制5M LiCL沉淀液（配制方法為：稱取LiCL 42.4g，Tris 0.4846g，EDTA 0.5846g溶于150ml DEPC處理水中，用5N NaOH 高PH 為7.4，之后DEPC處理水定容到200ml，高壓滅菌），等量加入提取后的RNA中，-80度靜置兩小時(shí)，拿出后4度，14000rpm離心20min， 棄上清，可看到半透明狀的沉淀。用預(yù)冷的75%乙醇清洗沉淀一次，7500rpm 離心5min，發(fā)現(xiàn)沉淀變成乳白色，加DEPC處理水，發(fā)現(xiàn)此沉淀很難溶解（已室溫靜置約10min，不溶，進(jìn)行漩渦振蕩，也不溶），隨后，直接用此未完全溶解的RNA提取樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OD260/OD280大于1.8，有的甚至在2.0以上 ，但制膠電泳檢測(cè)，加樣孔仍會(huì)發(fā)亮，蛋白質(zhì)仍舊沒有除盡。 對(duì)于此文庫構(gòu)建，我已進(jìn)行半年多，仍舊沒有進(jìn)展，問題總是出現(xiàn)在RNA的提取上。究竟要怎樣才能除盡RNA中的蛋白質(zhì)呢？請(qǐng)高手幫忙，感激不盡！�。� |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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4樓2013-05-16 12:21:21
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含羞草liu
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3樓2013-05-16 10:33:45
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5樓2013-05-16 14:04:57
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