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求動物（豬牛羊雞鴨）細胞線粒體的提取分離方法
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要完整的線粒體，不是線粒體DNA或者其他組分，謝謝了 |
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志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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- 專業(yè): 高分子組裝與超分子結(jié)構(gòu)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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制備線粒體采用組織勻漿懸液介質(zhì)中進行差速離心的方法。在給定的離心場中（對于所使用的離心機，就是選用一定的轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部。細胞器中最先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次分離。 舉例：新鮮的豬肝臟 1. 制備豬肝細胞勻漿。實驗前購買新鮮豬肝臟備用。 割取一小塊肝組織，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織1g，剪碎， 用預冷到0-4℃的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0-4℃條件下，按每克肝加4ml冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分數(shù)次添加，勻漿用雙層紗布過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。 2. 差速離心。 先將5ml 0.34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入5ml肝勻漿使其覆蓋于上層，用高速冷凍離心機進行差速離心。 3. 濾液經(jīng)700×g離心10min，分離核和雜質(zhì)沉淀。 4. 取上清液10 000×g離心10min，沉淀為線粒體。 5. 沉淀經(jīng)再次洗滌、離心后，即可得到純度較高的線粒體。 6. 分離物鑒定。 懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持 細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在 pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。 整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持 4 ℃，避免酶失活。 線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠 B （ Janus green B ）是對線粒體專一的活細 胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體 的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色， 而細胞質(zhì)中的染 料被還原成無色。 |
2樓2013-05-25 02:09:25
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