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s24512453新蟲 (初入文壇)
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[求助]
藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)中對照組平板長出很多菌落 但是實(shí)驗(yàn)組平板上一個(gè)菌落沒有
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1.PCR擴(kuò)增出1000bp的目的基因，電泳后膠回收，目的基因兩端的酶切位點(diǎn)分別是ECOR1和BAMH1（引物是自己設(shè)計(jì)） 2.對質(zhì)粒pUC18（2686bp，具有氨芐抗性，可用于藍(lán)白斑篩選）進(jìn)行雙酶切，兩個(gè)酶分別是寶生物的ECOR1和BAMH1（這兩個(gè)酶的酶切buffer和酶切溫度都不相同，通用buffer表中建議使用bufferK，在bufferK中ECOR1的酶切效率是120，BAMH1是100，那個(gè)120讓我很詫異）。按照說明書添加相應(yīng)的量，先30℃ECOR1酶切5min，之后再37℃BAMH1酶切5min（3h以及過夜都試過）。分別設(shè)立單酶切對照組：ECOR1 30度單酶切、BAMH1 37度單酶切（對照試驗(yàn)buffer都是K）。電泳檢測表明三者都處于同一位置的條帶上，（單酶切都切開了，雙酶切應(yīng)該沒有問題）而未經(jīng)過酶切的質(zhì)粒則單獨(dú)在另一位置，相差500bp左右。之后對雙酶切質(zhì)粒進(jìn)行膠回收。 3對目的片段進(jìn)行雙酶切，條件同上，電泳之后膠回收（酶切之前目的片段已經(jīng)是經(jīng)過膠回收后的，酶切后再進(jìn)行回收，條帶很暗，但是還是有，濃度無法精確估計(jì)）。 4目的片段和質(zhì)粒的鏈接：采用寶生物的鏈接試劑盒，載體和目的片段的比例試過1:10和1:3，加入solution1后16度半小時(shí)（16度過夜也試過）。 5將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（寶生物）中，轉(zhuǎn)化過程都按照說明書進(jìn)行，對照組是空質(zhì)粒pUC18和無菌水。加入無菌水的平板不長菌(大腸桿菌本身沒有氨芐抗性)；空質(zhì)粒pUC18的平板都是藍(lán)色菌落（說明pUC18進(jìn)入了大腸，表達(dá)了氨芐抗性），重組質(zhì)粒的平板上什么菌都沒有（長時(shí)間培養(yǎng)也沒有，4度冰箱長時(shí)間放置也沒有） 寫的過于繁雜，但求高手指點(diǎn)�。�！ |
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cicelyzh
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| 目的片段設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的5‘端是否加了保護(hù)堿基？雖然EcoRI和BamHI都是很好用的酶，切目的片段時(shí)由于位點(diǎn)位于片段的尾端，酶切時(shí)間也應(yīng)該適當(dāng)延長來確保酶切效率。此外，目的片段做了兩次膠回收，損失會(huì)比較大。如果PCR只有一條帶，PCR后和酶切后都可以不用膠回收，直接用PCR產(chǎn)物回收kit就可以了。 |
2樓2013-05-24 05:36:08
s24512453
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4樓2013-05-24 11:03:15
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