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zd0017鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
誠心求助，關(guān)于芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備�。。。。�
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| 誠心求助，我要做一株萎縮芽孢桿菌的基因敲除，在電轉(zhuǎn)之前需要做這株菌的感受態(tài)細胞，以前從來沒有做過，是個實驗菜鳥，誠心希望各位做過類似實驗的給點建議或相關(guān)資料，最好說下具體步驟，和實驗中需注意的細節(jié)，小妹感激不盡�。。。�！ |
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志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
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laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2013-05-28 20:35:05
laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2013-05-28 20:35:05
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芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化 1) 將菌種接種在LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。 2) 用接種環(huán)接一環(huán)菌苔于5mL GM I 溶液，在30 ℃慢搖床（125 r/min）振蕩培養(yǎng)過夜。 3) 次日取2 mL轉(zhuǎn)接到18 mL GM I 中，37 ℃快搖床（250 r/min）培養(yǎng)3.5 h。 4) 再取10 mL上一步驟的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到90 mL GM II 中，37 ℃慢搖床培養(yǎng)90 min后5,000 g，10 min離心收集菌體。 5) 用10 mL原培養(yǎng)液上清液輕輕懸浮菌體，懸浮后的菌體即為感受態(tài)細胞可以直接用來轉(zhuǎn)化。 6) 感受態(tài)細胞的保存：加30%的滅菌甘油至終濃度為10%，混勻后分裝到離心管中（0.5 mL/tube），隨即放到-70 ℃保存。 7) 轉(zhuǎn)化時取出離心管，放在45 ℃水浴中溶化，然后在0.5 mL菌液中加入適量DNA（～1 ug/ml）。 8) 于37 ℃振蕩（200 r/min）保溫30 min后涂布相應(yīng)抗性平板，再在37 ℃培養(yǎng)過夜，次日檢查和驗證轉(zhuǎn)化子。 普通化學(xué)感受態(tài)細胞制備用試劑 [1] 10×最低鹽溶液：K2HPO4 70 g，KH2PO4 30 g，（NH4）2SO4 10 g，（Na3C6H5O7•2H2O）5 g，MgSO4•7H2O 1 g，在蒸餾水中依次溶解，加水至500 mL。 [2] 氨基酸溶液（根據(jù)不同菌株的基因缺陷型準備）：10 mg/mL，貯于棕色瓶內(nèi)，113℃滅菌30 min，用黑紙包裹。 [3] GM I溶液：1×最低鹽溶液95.6 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL（50 μg/mL）。 [4] GM I溶液：1×最低鹽溶液96.98 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，10%酵母汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL（2.5 mM），1 M CaCl2 0.05 mL（0.5 mM），10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL（5 μg/mL）。 |
2樓2013-05-26 02:02:46
zd0017
鐵蟲 (小有名氣)
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3樓2013-05-26 17:45:37
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