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echochen1017新蟲 (初入文壇)
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[求助]
提質(zhì)粒酶切
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1、從BL21-pET28a-gene中提取質(zhì)粒，有的提不出來，然后對提出來的酶切，pET28a居然在一個小時左右被切碎（電泳無條帶，只有瀑布狀的東西）。 2、將目的基因與pET28a連接，轉(zhuǎn)化入BL21中，抗性篩選出菌落，培養(yǎng)，蛋白表達（量少，基本不表達），酶活檢測，對底物具有活性，且重復三次結(jié)果一致，呈現(xiàn)質(zhì)粒構(gòu)建成功的狀態(tài)，但是提質(zhì)粒后，卻沒有條帶，求大神解答��！ |
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-05 12:00:01
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-05 12:00:01
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我覺得不適合從BL21菌株中提取質(zhì)粒，BL21是個表達菌株，不妨可以分析一下其基因型，基因型如下： BL21(DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ– 通過將BL21(DE3)與DH5α比較，你會發(fā)現(xiàn)，BL21（DE3）中存在endA1和 recA1，這兩個基因中前者編碼核酸內(nèi)切酶，后者編碼重組酶，也就是說質(zhì)粒轉(zhuǎn)進BL21是不穩(wěn)定的即容易被降解和重組 所以你從BL21中提取質(zhì)粒，有的提不出來，對提出來的酶切，在一個小時左右被切碎（電泳無條帶，只有瀑布狀的東西）是很正常的 [ Last edited by gyesang on 2013-6-2 at 16:17 ] |
4樓2013-06-02 15:08:57
gyesang
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